分子相互作用実験：CUT& ;TAGターゲット切断とラベル化

一、技術概要

CUT&TAGは抗体誘導に基づく標的染色質切断とラベル化の高感度見掛けゲノム解析技術であり、この技術は伝統的なChIP-seqの低感度、高背景騒音、サンプル需要量が大きいなどのボトルネックを克服し、単細胞レベルで群タンパク質修飾、転写因子結合などの染色質特徴を解析することができ、見掛け遺伝学研究の新しい方向。

二、技術原理

CUT&TAGは4段階の重要な反応を通じて正確な染色質分析を実現する：

1.抗体標的定位：特異的な一次抗体（例えばH 3 K 4 me 3抗体）は目標染色質領域に結合し、Protein A/G二次抗体はTn 5転座酵素複合体（配列決定継手を含む）を運ぶ。

2.ターゲット切断とラベル化：Tn 5転座酵素は抗体誘導の下で、標的染色質に対してDNA二本鎖切断と継手接続を行い、切断範囲：標的部位の両側にそれぞれ約50-300 bpである。

3.DNA断片放出：プロテアーゼKは染色質架橋を消化し、継手付きDNA断片を放出する。

4.ライブラリー構築とシーケンシング：PCRは目標フラグメントを増幅し、Illuminaシーケンシングライブラリーを構築し、シーケンシング深さ：-20 million reads/sample（ChIP-seqより50%減少）。

三、応用シーン

CUT&TAGは単細胞レベルで腫瘍微小環境中の異なるサブグループの見かけ上の遺伝的差異を明らかにした。

例：

1.三陰性乳癌：単細胞CUT&TAGを通じてFOXA 1制御のスーパーエンハンサーが基底様亜型中で特異的に活性化することを発見し、これらのエンハンサーはEMT（上皮-間質転化）キー遺伝子（例えばSNAI 1）の発現を駆動し、転移を促進する。

2.急性髄系白血病：再発患者の骨髄サンプルを追跡し、CD 34+幹細胞中のH 3 K 4 me 1修飾の動態変化を同定し、これらの変化は化学療法耐性の産生を予告し、見掛け標的治療に新しい標的を提供する。

3.胚発育見掛け再プログラム：CUT&TAGは早期胚発育における群蛋白修飾の動的確立過程を追跡することができる。

4.マウス着床前胚：H 3 K 9 me 3は2-cell段階で堆積を開始し、LINE-1などの逆転写転写転写転写転写体領域を優先的に標識し、この修飾は転写体活性を抑制することによりゲノム安定性を維持した。

5.ヒト胚性幹細胞：神経分化におけるH 3 K 27 acの動的スペクトルを描画し、SOX 2とOCT 4によって制御されたエンハンサーネットワークを位置づけ、多能性脱退キーノードを明らかにする。

6.免疫細胞機能制御：T細胞分化と機能状態の見かけ上の基礎を解析する。

7.T細胞枯渇：慢性ウイルス感染モデルにおいて、枯渇性CD 8+T細胞のH 3 K 27 acがPD-1とTIM-3遺伝子座に異常に濃縮されていることが発見され、これらのエンハンサー活性はTOX転写因子によって直接制御されている。

8.調節性T細胞（Treg）：ATAC-seqとの併用により、FOXP 3はH 3 K 4 me 3修飾を再構築することにより、EZH 2媒介のH 3 K 27 me 3協同抑制に依存するTreg細胞の抑制性機能を安定化することが明らかになった。

四、技術優勢

1.高感度（100細胞レベル検出）：Tn 5転座酵素は標的部位で直接切断し、配列決定継手を接続し、ChIP-seq中のDNA断片化（超音波破砕）によるランダム損失を回避する。CUT&TAGの信号対雑音比はChIP-seqに比べて8倍（S/N=12：1 vs 1.5：1）向上し、検出された差異ピーク数は40%増加した。

2.単塩基分解能と正確な定位：抗体-Tn 5複合体は結合部位付近のDNA（±50 bp）のみを切断し、ChIP-seqの超音波破砕は200-500 bpランダム断片を生成する。p 53結合部位分析では、CUT&TAGは単一の狭窄ピーク（ピーク幅≒30 bp）を検出し、ChIP-seqはTTGCCTモチーフ中心に正確に位置する広いピーク（ピーク幅≒200 bp）を示した。

3.単細胞と空間見かけ集団学的互換性：10 x Genomicsプラットフォームと連携し、マイクロフロー制御により単細胞と抗体-Tn 5複合体を油滴に包み、単細胞H 3 K 27 acマップ構築（Nature Methods、2022）を実現した。

4.新たに開発されたSpatial CUT&Tag技術は、組織スライス上にH 3 K 4 me 3のサブ構造分布を位置決めすることができ、例えばマウス脳スライス中に海馬領域ニューロン活性相関修飾を可視化することができる。

五、サンプルタイプ

新鮮細胞（壁貼り細胞／懸濁細胞）、凍結保存細胞、凍結保存組織。

六、サンプル需要

細胞サンプル：約100,000個（24ウェルプレートの1ウェル、または懸濁細胞の形で遠心管に保存することができる）、

凍結保存組織：約10-20 mg。

七、サンプル準備&輸送

生細胞サンプル：距離が近いものは新鮮なサンプルを提供でき、皿/遠心管内に培養した新鮮な細胞サンプルを常温速達（遅くとも翌日到着）で輸送し、本市内でフラッシュまたは直接配達することができる、距離が遠い場合は、−80℃で凍結保存細胞のドライアイス輸送が可能である、

組織サンプル：−80℃で凍結保存したドライアイス輸送。

八、提供する試薬

ChIP級抗体（ない場合はIF級抗体も選択可能）

九、実験周期

1～2週間（シーケンシングを含まない）

十、その他

後続検出Rrealtime PCR/シーケンシング