ウイルスゲノムDNA/RNA高速抽出キット

商品の属性：

ポリメラーゼ連鎖反応基本的な手順と注意事項？

一、実験原理

ポリメラーゼ連鎖反応インビトロ人工選択的増幅であるデオキシリボ核酸生物体内に似た方法ですデオキシリボ核酸のコピーを作成します。デオキシリボ核酸コピーにはテンプレート、プライマー、デオキシリボ核酸ポリメラーゼ、デオキシリボ核酸分解酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸;体外ポリメラーゼ連鎖反応反応には同様の成分が必要であり、テンプレート、プライマー、PCR Buffer、タッカー酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR緩衝液反応の緩衝環境を提供する、反応過程は生体内と同じで、デオキシリボ核酸これらの過程は生物体内ではデオキシリボ核酸分解酵素は鎖を分解し、体外では反応温度を制御することによって実現される。一般的な94℃へんせいテンプレートデオキシリボ核酸二本鎖を開き、アニール温度でプライマーをテンプレートに結合し、最後に72℃延長を完了し、この手順を繰り返して特定のフラグメントを実装するデオキシリボ核酸の大量増幅。第3サイクルが始まるまで射出と標的は生まれませんデオキシリボ核酸セクションが同じDNA分子、さらに循環的に標的を生成するデオキシリボ核酸セグメントの指数が倍になる。

増幅後,生成物の蓄積による,,生成物は循環数とともに明らかに上昇しなくなった,これをプラットフォーム効果と呼ぶ。プラットフォーム期間（高原）ミスマッチによる低濃度非特異性生成物の大量増幅を継続し、高いレベルに達することができる。そのため、循環回数を適切に調節し、プラットフォーム期間前に反応を終了し、非特異性生成物を減少させるべきである。プラットフォーム到着期間（高原）必要なサイクル数は、サンプル中のテンプレートのコピーに依存します。

二、主な成分

1.テンプレートは、主にゲノムを含む様々な形態であってもよいデオキシリボ核酸、プラスミドデオキシリボ核酸、ウイルスを運ぶゲノムデオキシリボ核酸、ポリメラーゼ連鎖反応生成物、cDNA等，但不能为リボ核酸。異なるタイプのテンプレートでは、プレトランスフォームの時間とテンプレートの量が主に異なります。一般的に大きなゲノムに対してデオキシリボ核酸よへんせいじかん10分十分、プラスミドDNA 2分、ウイルスを運ぶゲノムデオキシリボ核酸よへんせい2分間、ポリメラーゼ連鎖反応せいぶつよへんせい2分間をオフにします。

注意cDNA为单链デオキシリボ核酸が、それでもできますポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートは、第1サイクルの時に1つのプライマーだけが結合し、別の鎖を合成するにすぎない。第2ラウンドから2つのプライマーが特異部位に結合し、従来のポリメラーゼ連鎖反応のジョイントレールです。同じ単鎖のリボ核酸できないポリメラーゼ連鎖反応拡大の原因は実現にあるポリメラーゼ連鎖反応反应的是デオキシリボ核酸ポリメラーゼは、わざわざ識別することしかできませんデオキシリボ核酸チェーン。

2.テンプレートの量については、一般的に25ul体系デオキシリボ核酸の品質は50,100ナノグラム。ゲノムの場合デオキシリボ核酸その構造は比較的に複雑であるため、抽出の濃度も比較的に大きくなりがちで、濃度が大きすぎることを防止するためにポリメラーゼ連鎖反応影響を与えるため、抽出するデオキシリボ核酸勾配希釈を行う。濃度が高すぎると非特異的な増幅を引き起こす可能性があります。プラスミドおよびポリメラーゼ連鎖反応生成物はその構造が簡単であり、抽出濃度が一般的に低いため、希釈する必要はない。

ポリメラーゼ連鎖反応実験で注意すべき問題は何ですか。?

ないCT値

検出結果が検出されましたかCT値の状況,次の問題があるかどうかを調べる:

1(一般的に超えない45循環,背景値だけでなく,定量的にも正確ではない);

2、ポリメラーゼ連鎖反応プログラム設定エラー,蛍光信号を検出する手順が間違っている。一般的シンガポール法の採用72℃延長時に収集TaqMan法則は一般的にアニール終了時や延伸時に信号を収集する,また蛍光採取の有無;

3通過可能ページ電気泳動はプライマーとプローブが分解したかどうかを検出する;

4、テンプレート量が分解したり、サンプル量が不足したりする可能性があります(超えない500ng，キット説明書に従えばよい),未知濃度のサンプルについては、シリーズ希釈サンプルの最高濃度から始めなければならない;テンプレート分解が発生した場合,サンプル準備における不純物の導入及び凍結融解を繰り返す場合を考慮すべきである,,繰り返し凍結融解を避ける;

5、プライマープローブが適切か(特にプライマーは内包子を横切る,ゲノムの増幅を確実にするためにDNA；上下流プライマーサンショウウオ.值超过4℃以上も増幅に影響します)。

CT値が遅すぎる

相対定量では，Ct値は一般的に1525間がいい,絶対定量では,低コピー数のサンプル，Ct値が大きくなります,でも普通は超えるべきではありません40循環,そうでないと定量的に正確ではありません。

したがって,判断CT値が遅すぎて正常でないかどうか,

1、増幅効率が低い。プライマー間またはプライマーとプローブの割合が不適切である,最適化が必要;プライマーまたはプローブの設計が不合理である,再設計が必要;

2、ポリメラーゼ連鎖反応プログラムが合わない,三段階法に変えて反応する,又は最適化焼鈍/,アニール温度を適切に下げることができる;焼きなまし/延長時間が短い(推奨された時間条件で延長できます10秒）、

3、塩化マグネシウム濃度が不適切である,マグネシウムイオン濃度などを増加させる。ポリメラーゼ連鎖反応各種反応成分の分解又は添加量の不足;

4、ポリメラーゼ連鎖反応産物が長すぎる。ポリメラーゼ連鎖反応製品設計が500bp；

5、テンプレートに抑制物が存在する。高純度テンプレートで行うポリメラーゼ連鎖反応テンプレートを希釈するか、テストします。

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