TRzol LS（液体サンプルRNA抽出試薬）

商品の属性：

保管条件：

TRzol LSは室温で12ヶ月間安定して保存できる。それでも、最適な効果を得るためには、2 ~ 8°Cの環境で保存することをお勧めします。

重要なヒント：

毒物が皮膚に触れたり、誤って飲み込んだりすると、やけどを引き起こすことがあります。肌に触れるとすぐに大量の洗剤と清水で洗います。気分が悪くなったら、医者に診てもらい、他の成分との正しい治療案を求めます。

製品紹介：

TRzol LS試薬は、細胞または組織から総RNAを直接抽出する試薬である。細胞を破砕し溶解する際にRNAの完全性を維持することができます。RNAは水様層に存在する。上の水サンプル層を収集した後、RNAはイソプロパノール沈殿により回収することができる。ヒト、動物、植物、細菌にかかわらず、この方法は少量及び大量の組織と細胞に対して比較的に良い分離効果がある。TRzol LS試薬の操作上の単純性は、同

時に複数のサンプルを処理する。すべての操作は1時間以内に完了できます。TRzol抽出した総RNAはDNAと蛋白質の汚染を避けることができ、RNAインプリント分析、斑点ハイブリダイゼーション、poly（A）＋スクリーニング、invitro翻訳、RNA酵素保護分析と分子クローンに用いることができる。PCRの場合、2つのプライマーが単一エキソン内にある場合は、抽出された総RNAを増幅段のDNase Iで処理することをお勧めします。

注意事項：

1.少量の組織（1〜10 mg）または細胞（10〜10個）からRNAサンプルを分離する：組織または細胞に800µl TRzolを添加する。試料が分解されたら、クロロホルムを添加し、ステップ2の抽出操作を行った。RNAをイソプロパノールで沈殿させる前に、RNA酵素を含まないglycogenを水様層の担体として5 ~ 10μg添加した。Glycogenは水様層に留まり、RNAと共析出する。4 mg/mlに濃縮するまでは、逆転写反応の第1鎖の合成もPCRも抑制しない。

2.均質化後及びクロロホルム添加前に、サンプルを−60℃又は−70℃で少なくとも1ヶ月保存することができる。RNA沈殿物を75%に溶解したエタノールは、2〜8℃で少なくとも1週間、−5〜20℃で少なくとも1年間保存することができる。

3.TRzol LSでRNAを抽出する際は手袋と眼帯を着用する。肌や服に触れるのを避ける。化学換気ケースで作業を完了します。気道吸入を避ける。例外がなければ、室温は15〜30℃の条件で維持される。

クロロホルム、イソプロパノール、75%エタノール（RNase-Free water調製）、RNase-Free water（RNA酵素のないガラス瓶に水を加え、DEPCを0.1%（V/V）に添加した。一晩放置し、オートクレーブした）。0.5%SDS溶液（RNase-Free water配合）（オプション）。

操作手順：

1.試料前処理a.生体液体0.25 ml液体試料（血清、血漿など）当たり0.75 ml TRzol LSを添加し、試料中の細胞の溶解を助けるために液体試料を注入ガンで数回吹き付けた。5〜10×106細胞当たりTRzol LS 0.75 mlを少なくとも添加した。全血サンプルなどの高汚染物質を含むサンプルについては、滅菌水を1：1の割合で2倍希釈してから抽出を開始することができる。TRzol LSと液体試料の最終体積比は常に3：1であった。b.組織用glassまたは強力ホモジナイザーを用いて組織サンプルを攪拌し、組織懸濁液50 ~ 100 mg当たり0.25 mlにTRzol LS 0.75 mlを加えた。一般的に50 ~ 100 mgの組織体積はいずれも0.25 ml未満であり、組織サンプルの体積が0.25 ml未満であれば、滅菌水を加えて組織サンプル体積を0.25 mlに調整し、体積比率が3:1であることを保証する。必要なTRzol LS量は、細胞の数ではなく培養プレートの面積に基づいて決定される（10 cm 2当たり0.3〜0.4 ml加算）。培養プレートに付着して残った培養液はTRzol LSを十分に希釈しているので、分解物に水を加える必要はありません。d.懸濁成長した細胞は遠心分離により細胞を沈殿させる。TRzol LS試薬中で溶解細胞をピペットで繰り返し吹き込んだ。5〜10×106の動物細胞当たり、植物または酵母細胞、または1×107細菌当たり0.75 mlのTRzol LSを加えた。ステップbと同様に滅菌水を用いてサンプル体積を0.25 mlに調整した。TRzol LSを添加する前に細胞を洗浄することは避けなければならない。それはmRNA分解の可能性を高めるからである。破裂した酵母菌や細菌の中には、ホモジナイザーを使用する必要がある場合があります。2.分離段階で15〜30℃の条件下で均質試料を5分間インキュベートし、核蛋白質体を分解した。TRzol LS 0.75 mlにつきクロロホルム0.2 mlを添加した。2 ~ 8°Cで12000×gを超えない遠心力で15 min高速冷凍遠心分離した。遠心分離後の混合物は3層に分けられる：下層-クロロホルム層、中間層、上層無色の水様層。RNAは例外なく水様層中に存在する。水サンプル層の容量は、追加されたTRzol LS容量の約70%である。

2.RNAの沈殿は水試料層をきれいな試験管に移し、DNAとタンパク質、有機層と中間層を分離したい場合は同様に保持しなければならない。水様層とイソプロパノールを混合することによりRNAを沈殿させた。TRzol LS 0.75 ml当たり、イソプロパノール0.5 mlに対応する。混合したサンプルを15〜30℃の条件下で10分間インキュベートし、2〜8℃で12000×gを超えない遠心力で10分間高速冷凍した。RNA沈殿は遠心前には通常見られず、遠心後には試験管壁と管底に付着するコロイド状のシート状沈殿物が形成される。

3.RNAのすすぎは上層懸濁液を除去する。RNAを75%エタノール（RNase−Free water配合）で洗浄して沈殿させ、TRzol LS 0.75 ml当たり少なくとも1 mlの75%エタノールを加えた。

4.RNAの再溶解室温でRNA沈殿を簡単に乾燥させ、真空管内でRNAを遠心乾燥させない。特に重要なのは、RNAを沈殿乾燥させることができないように可溶性を大幅に低下させることである。部分的に溶解したRNA試料のOD 260／OD 280比は1.6未満であった。RNAを溶解するためにピペットを用いてRNase−Free waterまたは0.5%SDS溶液（RNase−Free water調製）を数回に分けて移した（RNAが後で酵素切断反応に使用する場合、SDSの使用を避ける。）RNAはまた、100%ホルムアミド（イオン除去）によって再溶解され、−70°Cに保存される。

PCRの基本手順と注意点は？

一、実験原理

PCRは体外人工的にDNAを選択的に増幅する方法であり、生体内DNAの複製に類似している。生体内でのDNA複製にはテンプレート、プライマー、DNAポリメラーゼ、DNAデスピナーゼ、dNTPsが必要である、体外PCR反応には同様の成分が必要であり、テンプレート、プライマー、PCR Buffer、Taq酵素、dNTPs。プライマーは人工的に設計された特定の配列であり、特定の位置への増幅を実現する、PCR Bufferは反応の緩衝環境を提供する、これらのプロセスは生体内でDNAデスピナーゼによって鎖を分解するが、体外では反応温度を制御することによって実現される。通常94℃変性鋳型DNAが二本鎖を開き、アニール温度でプライマーを鋳型に結合し、最後に72℃で延伸を完了し、この過程を繰り返して特定断片DNAの大量増幅を実現することができる。第3のサイクルが開始されるまで標的DNAセグメントと同じDNA分子が生成され、さらに循環的に標的DNAセグメントの指数倍が生成される。

増幅後期には、生成物の蓄積により、本来指数的に増幅されていた反応が平坦な曲線になり、生成物は循環数によって明らかに上昇しなくなり、これをプラットフォーム効果と呼ぶ。プラットフォーム期間（Plateau）は、ミスマッチによる低濃度非特異性生成物の大量増幅を継続し、高いレベルに達する。そのため、循環回数を適切に調節し、プラットフォーム期間前に反応を終了し、非特異性生成物を減少させるべきである。プラットフォーム期間（Plateau）に到達するために必要なサイクル数は、サンプル中のテンプレートのコピーに依存します。

二、主な成分

1.テンプレートは、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ウイルスを運ぶゲノムDNA、PCR産物、cDNAなどを主に含む様々な形態であってもよいが、RNAではない。異なるタイプのテンプレートでは、プリトランスフォームの時間とテンプレートの量が主に異なります。一般的に大きなゲノムDNA予備変性時間に対して10 minで十分であり、プラスミドDNA 2 min、ウイルスを運ぶゲノムDNA予備変性2 min、PCR生成物予備変性2 minであればよい。

cDNAは単鎖DNAであることに注意して、しかし依然としてPCRの鋳型をすることができて、ただ第1ラウンドの循環の時に1つのプライマーだけが結合して、別の1本の鎖を合成します。同じ単鎖であるRNAでもPCR増幅ができないのは、PCR反応を実現するのはDNAポリメラーゼであり、わざわざDNA鎖を識別するしかないからだ。

2.テンプレートの量に対して、一般的に25 ul系DNAの質量は50100 ngである。ゲノムDNAに対してはその構造が複雑であるため、抽出の濃度も比較的に大きく、濃度が大きすぎてPCRに影響を与えることを防止するために、抽出したDNAを勾配希釈する必要がある。濃度が高すぎると非特異的な増幅を引き起こす可能性があります。プラスミド及びPCR生成物については、その構造が簡単であり、抽出濃度が一般的に低いため、希釈する必要はない。

PCR実験で注意すべき問題は何ですか。

ct値なし

検出結果にCt値がない場合は、次の問題があるかどうかを確認します。

1、循環数が足りない（一般的には45サイクルを超えず、背景値が向上するだけでなく、定量も正確ではない）、

2、PCRプログラムの設定が間違っており、蛍光信号を検出するステップが間違っている。一般的なSG法は72℃延伸時に採取し、TaqManの法則は一般的にアニール終了時または延伸時に信号を採取し、また蛍光採取が選択されているかどうか、

プライマーとプローブが分解したかどうかをPAGE電気泳動によって検出することができ、

4、テンプレート量は分解したり、サンプル量が不足したりする可能性がある（500 ngを超えず、キットの説明書に従えばよい）、未知濃度のサンプルに対してシリーズ希釈サンプルの最高濃度から始めなければならない、テンプレート分解が発生した場合、サンプル準備中の不純物の導入及び繰り返し凍結融解の情況を考慮し、テンプレートサンプルを少量分装備蓄し、繰り返し凍結融解を避けることを提案し、

5、プライマープローブが適切であるか（特にプライマーはイントロンを越えてゲノムDNAの増幅を確保するため、上下流プライマーTm値が4℃以上を超えると増幅にも影響する）。

ct値が遅すぎる

相対定量では、Ct値は一般的に1525の間に制御されるのが好ましく、絶対定量では、低コピー数のサンプルではCt値が増大するが、一般的には40サイクルを超えるのは望ましくない、そうでなければ定量は正確ではない。

そのため、Ct値が遅すぎるのが非正常かどうかを判断するには、具体的な実験設計と目的に基づいて行う必要がある。

1、増幅効率が低い。プライマー間またはプライマーとプローブの割合が適切ではなく、最適化する必要があります。プライマーやプローブの設計は不合理で、再設計が必要である。

2、PCR手順が不適切で、三段階法に変えて反応を行い、或いはアニール/延伸温度を最適化し、アニール温度を適切に下げることができる、アニール／延伸時間が短い（推奨時間条件下で10 s延ばすことができる）、

3、MgCl 2濃度が不適切で、マグネシウムイオン濃度を増加するなど。PCRの各種反応成分の分解または添加量の不足、

PCR製品の設計は500 bpを超え、

5、テンプレートに抑制物が存在する。高純度テンプレートを用いてPCR検査を行ったり、テンプレートを希釈したりします。

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