TOPO-TA/Bluntシンプルライトニングクローンキット

ノボライドTOPO-TA/Bluntシンプルライトニングクローンキット

TOPO-TA Bluntシンプルライトニングクローンキット

ディレクトリ番号：42212

製品内容：

保存条件：

-20℃、保管12 ヶ月、使用効果に影響しません。

製品概要：

TAクローニングまたはBluntクローニングは、室温条件下で20分で完了することができ、陽性率は100%に近く、氷浴、熱刺激フリー、青白斑フリースクリーニング、10 kbまでのDNA断片を接続することもできる。

クローン手順：

ステップの簡略化（≤10kb フラグメント） 回復フリー、液体フリーの場合は、次の操作を行います。（英語）：Recoveryフリー、液体フリーの場合は、次の操作を行います。（英語）：Recoveryフリー、液体フリーの場合は、（英語）。（英語）：Recoveryフリー。（英語）：Recovery ポンド

1、接続：室温5時計；

1、接続： 37℃接続 5 分。

2、変換：室温 5 鐘；

2、変換：氷浴 5 min，42℃熱刺激 1 min，氷上 2 分。

3、回復：180 rpm、37℃発振培養10 分;塗板。

3、全菌液塗布板を採取し、37℃で逆さ培養した。

1. ポリメラーゼ連鎖反応生成物の製造：

一 プライマー要求：プライマーはリン酸化できない。

b 酵素の選択：必要に応じて選択するDNA 互換性のあるポリメラーゼポリメラーゼ連鎖反応 生成物のA. 末端と平和末端。

c 電気泳動検出PCR生成物の量と品質：

①目的のストリップのみがあり、直接接続反応を行うことができ、精製する必要がない、

③プラスミドをテンプレートとして増幅する場合は、テンプレートプラスミドにも目的外コロニーが生えるため、ゲル回収を行わなければならない。

2. 接続反応：

1） 室温（20℃〜37℃）で接続系（10 ul 体系）：

異なるサイズの挿入クリップの推奨使用量：

試薬を添加した後、軽量弾管の底を均一にする（または軽く吹き付けて均一にする））を選択して、遠心管の底にすべての液体を集めます。

2) 室温（20℃〜37℃）せつぞく5 分です。結合生成物は、直接感受性細胞を形質転換してもよく、または氷の上に置いて予備としてもよい。

3. 変換、蘇生、塗装板：

1）100マイクロリットル 約1 分程度）、軽く何度かはたきをかけて細胞を均一に懸濁させた。

2） に参加10 ul接続液、軽く混ぜて、室温（20℃-37℃）配置＃ハイチ＃5分です。

3） に参加500ul室温に平衡したポンドまたは安全運営センター 培地（抗生物質を含まない）、37℃180 回転数しんどうばいよう10 分。

（注：より大きい3kb の断片を用い、発振培養時間を30〜60に延長 分で、形質転換子を増やすことができます。または簡略化ステップでは、次の操作を実行します。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）。（英語）

4） 取200l 菌液塗布板（アンモニアベンジルqingマイシン含有50-100ug/ml），一晩培養する。（より多くのクローンを得るために、4000 回転数 遠心分離1 min，吸引・廃棄部分の上澄み、保持100-150ul，

注：使用する場合5ul 系で、各成分は割合に応じて半減し、使用回数は倍にすることができる。

4. 形質転換子のフィルタ同定：

本製品の陽性率はかなり高く、一般的には、成長したコロニーが正常であれば（汚染されていない雑菌、形質転換子の数も少なすぎない）を選択すると、基本的に挿入が含まれます。したがって、挿入フラグメントは超過しません2-3kb の場合は鑑定しなくてもよい直接ピック1〜2個の菌脱配列測定。

1） コロニーポリメラーゼ連鎖反応 無菌水の中で、混合して、1 ulを取ります配置25ul ポリメラーゼ連鎖反応 システム、用PCRプライマーまたはM 13汎用プライマーは陽性クローンを同定する。

2）

pTOPO TA/Bluntキャリアスペクトル：

pTOPO TA/Blunt キャリアシーケンス：

TOPO-TA/Bluntシンプルライトニングクローンキット