pBLUE−TベクタークローニングキットT 4の原理ベクターその他

ノボライドpBLUE−TベクタークローニングキットT 4の原理ベクターその他

pBLUE-Tベクタークローニングキット

ディレクトリ番号：42014

キット組成、保管、安定性：

−20℃で保存し、6ヶ月以内に使用効果に影響しない。

具体的な製品のパラメータは製品説明書を受け取ったパラメータを基準とする

製品紹介：

Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼなどの高温DNAポリメラーゼ増幅PCR生成物の多くは3’-末端後にはいずれも突出した塩基Aがあり、このようなPCR生成物は3’-末端後に突出した塩基Tを有するベクターは、容易にクローン化される。pBLUE−TベクターはpBlueScriptII SK（+）プラスミドに由来し、EcoRI酵素カット部位に適切な配列を添加し、XCM I酵素カットを経てその3’末端が直接未対のT塩基を産生してなるため、より高い組換え効率がある。pBLUE−Tベクター挿入部位の両端に独自に設計された2つのECORI部位により、挿入フラグメントを安価で効率的なECORIモノ酵素で切断することができる、同時にpBLUE−TベクターはNdeIまたはNcoI制限エンド酵素部位を含まず、上述の酵素切開部位を含む遺伝子のクローニングに便利である。また、当社のキャリア接続システムには背景が低く（青斑は10%未満）、再結合率が高い（白斑の90%以上は挿入断片がある）、迅速に接続できるなどの特徴がある。

配列決定にはT 3、T 7プロモータープライマーとM 13汎用配列決定プライマーを用いることができる（後のスペクトルを参照）

操作手順：

1. 接続反応の準備：

PCR生成物を精製するかどうかは、増幅生成物の品質に依存する。PCR生成物が非常に清潔であれば、精製せずに結合反応を行うことができる。しかし、プラスミドをテンプレートとするPCR生成物であれば精製しなければならず、テンプレートプラスミドも白斑を形成する可能性がある。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動により分離することができる。当社製DNA産物の迅速精製回収キット対70 bp以上のDNA断片をうまく回収することができる。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNAポリメラーゼを増幅したPCR生成物は、その末端に突出した3’を持っている-A.。 ある3’-A末端のPCR生成物は、直接pBLUE−Tベクターを用いてクローン結合することができる。3’を有する®5’エキソザイム活性DNAポリメラーゼ（ハイファイ酵素）増幅PCR生成物は平末端であり、この平末端PCR生成物をクローニングするには、優良行3’-端加A作業。

2. 一般的な接続反応：

1）標準的な10米l連結反応系に1を添加する。【選択図】図1。【選択図】図1。【選択図1。【選択図】図1。【選択図1。【選択図】図1。【選択図1。【選択図】図1米l3pblue-tの0%キャリア、X米l PCR生成物（通常の状況では、ポリメラーゼ連鎖反応生成物は正確な定量を行い、一般的にPCR生成物と担体のモル比を2：1 ~ 10：1に最適化すると良好な結果が得られ、3：1を推薦する）、1米l 10´接続緩衝液および0.5-1米l(2.5-5 Weiss Units）のT 4 DNALigase，残りは水で補う。反応は以下のシステムで行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2）16℃で一晩接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

一般に16℃で一晩接続することを推奨する（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系標準リガーゼ量は2.5Weiss単位すなわち)、最も多くの形質転換子を得ることができる。しかし、本システムにはPEG Enhancerが含まれており、接続効率を数倍に高めることができます。★QADB 610:closed☆★QADB 610:closed☆★QADB 610:closed☆★QADB 610，高リガーゼ量の場合（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系推奨リガーゼ量5Weiss単位

3)氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。

3. 高速接続反応：

1）反応は以下の系で行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2）22℃で5〜10分間接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

2 ´Quick Ligation Bufferには最適化された高速接続成分がすべて含まれており、通常は22℃で10分間接続することを推奨しています。（英語）。（英語）：Quick Ligation Buffer（英語）：（英語）：（英語）（英語：Ku（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系リガーゼ量5Weiss Unitsまた本システムは16℃で30分間接続することもできる（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系リガーゼ量5Weiss Units）は一般的な研究の要求に達することができる。

3)氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。

4. 変換:

ð50-100米l感受性細胞を氷の上に置き、quan解凍後に軽くはたいて細胞を均一に懸濁させる。

ð4-5を追加米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）結合液（感受性細胞の体積の1/10以下の体積であれば、すべて添加することができます）は、軽く混合します。氷の上に置く30分です。42℃水浴熱刺激90氷の上に2を置く~ 3分です。

ðプラス500米LBまたはSOC培地（抗生物質を含まない）、37℃150 rpm発振培養60分。

ð200米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）細菌を事前に16米l 50mg/ml IPTGおよび40米l 20 mg/ml X−galコーティングアンモニアベンジルqingマイシン平板上。

ðプレートを37℃で1時間順方向に放置して過剰な液体を吸収し、その後一晩逆さまに培養した。
5フィルタ：

1).アダプタの青白フィルタ：

外来DNAフラグメントがpBLUE−Tに挿入されると中後、外因性のためDNAの核酸配列の存在はLacZ遺伝子のコードを変え、その生成物に影響を与えるbガラクトシダーゼ一フラグメントが活性であるため、組換えクローンはX-gal/IPTG平板上で青色ではなく白色に見える。時にはクリップの挿入に影響はありませんlacZ遺伝子はコードボックスを読んだり、挿入断片が小さすぎたりして、この場合コロニー（組換えクローン）は水色を呈したり、コロニー中心に淡青斑点を呈し、外周は白色（魚眼状青斑fish eye）である。IPTG/X−galプレート上に成長させた白色コロニーまたは水色コロニーを選択し、楊枝を用いてアンモニアベンジルqingマイシン含有液体培地に挑み、37℃で一晩培養した。
2).アダプタの同定：

a上記培養した白色コロニーの菌液を用いてプラスミドを抽出し、ECORIモノ酵素を用いて切断するか、または他の適切な酵素を用いて切断し、アガロースゲル電気泳動により断片の大きさを検査し、目的の断片を含有するかどうかを確定した。

b白色コロニーを採取して直接PCR検査を行う（分子クローンの第3版を参照するか、お問い合わせください）

c.目的のクローンが含まれるかどうかを決定するために、T 3およびT 7プロモータープライマーまたは他の適切なプライマー配列決定を使用する。

結合反応に必要なPCR生成物の量をどのように計算しますか。

一般的なPCR生成物と担体のモル比は2：1〜10：1（推奨3：1）に最適化すれば良好な結果が得られ、以下の式を採用することができる：

［添加担体の量（ng）×挿入断片の大きさ（kb）÷担体の大きさ（kb）］×挿入断片と担体のモル比＝挿入断片の量（ng）：例えば、挿入断片と担体の結合のモル比は3：1であり、例えば、結合反応に担体40 ngを添加し、挿入断片の大きさは1000 bpであり、この時に添加すべき挿入断片の量は［40 ng担体×1 kb挿入断片÷2.984 kb担体］×3／1＝40.2 ngである。

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