フィチン酸含有量検出キット微量法

フィチン酸含有量検出キット説明書

びりょうほう

商品番号：BC5845

仕様：100トン/48秒

製品構成：使用前に試薬の体積と瓶内の体積が一致しているかどうかを真剣にチェックして、疑問があれば直ちにソレボスタッフに連絡してください。

溶液の調製：

1、試薬2：使用前に4 mL試薬1を添加し、十分に溶解する、使い切れない試薬を-20℃で分注保存4周、繰り返し凍結融解を避ける、

2、試薬三：使用前に蒸留水2.36 mLを加えて十分に溶解し、さらにノズルを液面下に入れてゆっくりと加える0.64mL濃硫酸、十分に混合する、2〜8℃で保存可能4週;

3、試薬四：使用前に15 mLの蒸留水を加えて十分に溶解し、さらにノズルを液面下に入れてゆっくりと加える15μL濃硫酸、十分に混合する、2〜8℃で保存可能4週;

4、作動液：使用直前サンプル量に応じて試薬三：試薬四＝1 mL：5 mL（共6mL，40トン）の割合を均等に混ぜ、配置後当日使い切る、

5、標準品：使用前に1.08 mL試薬を入れて十分に溶解し、10μmol/mLフィチン酸標準品に調製し、2-8℃で4週間保存する。

6、250 nmol/mL標準品の調製：使用前に50μL 10μmol/mLフィチン酸標準品と450μL蒸留水を1μmol/mL標準品（すなわち1000 nmol/mL）に混合する、750μL蒸留水を混合して250 nmol/mLフィチン酸標準品を調製し、下記操作表標準管の測定に用い、現在配合している。

製品の説明：

フィチン酸（Phytic acid）、別名イノシトール六リン酸、シクロヘキサノール六リン酸、一般的に真核細胞に存在し、多くの細胞活動の中で重要な役割を発揮し、例えば：無機リンの定常状態を維持し、植物ホルモンの信号伝達に参与し、酵素の補助因子として参与するデオキシリボ核酸修復、リボ核酸編集とメッセンジャーリボ核酸出力。

一定の環境条件下で、フィターゼはフィターゼナトリウム（フィターゼ六リン酸十二ナトリウム）を分解して無機リンとフィターゼ誘導体を産生することができ、酸性条件下で、無機リンとモリブデン酸アンモニウム発色剤が反応し、青色のモリブデン青色物質を産生し、700 nmに特徴的な吸収ピークがあり、無機リンの含有量を測定することにより、フィターゼ含有量を計算することができる。

注意：実験の前に2〜3つの予想される差異の大きいサンプルを選択して予備実験を行うことを提案する。

持参する機器と用品：

可視分光光度計/酵素スケール、低温遠心分離機、水浴釜/恒温培養箱、分析天秤、微量ガラス比色皿/96オリフィスプレート、可変式ピペット、すり鉢/ホモジナイザー、濃硫酸（>98%，AR）、氷と蒸留水。

操作手順：

一、サンプル処理（測定すべきサンプル量を適切に調整でき、具体的な割合は文献を参照できる）

1.新鮮植物サンプル：品質（g）：抽出液一体積（mL）ために1：5~10の割合（約定と呼ぶことを推奨する0.1 g、加入1mL抽出液一）抽出液一を加え、十分に均質化した後、常温振動2時間を選択し、4℃，10,000 g遠心10分，取る0.8ミリリットル上澄み液、さらにゆっくり加える0.15ミリリットル抽出液2、ゆっくりと吹き付けて気泡の発生がなくなるまで混合し、4℃10000g遠心10分後に上清を取って測定を待つ。

（mL）ために1：5~20の割合（約定と呼ぶことを推奨する0.05 g、加入1mL抽出液一）抽出液一を加え、十分に均質化した後、常温振動2時間を選択し、4℃，10,000 g遠心10分，取る0.8ミリリットル上澄み液、さらにゆっくり加える0.15ミリリットル抽出液2、ゆっくりと吹き付けて気泡の発生がなくなるまで混合し、4℃10000g遠心10分後に上清を取って測定を待つ。

3.液体サンプル：100μLの液体を採取して添加する1mL抽出液一、常温振動2時間を選択し、4℃，10,000 g遠心10分，取る上澄み液、さらにゆっくり加える0.15ミリリットル抽出液2、ゆっくりと吹き付けて気泡の発生がなくなるまで混合し、4℃10000g遠心10分後に上清を取って測定を待つ。

注：抽出液二ゆっくり加える必要があり、加えると大量の気泡が発生するので、使用することをお勧めします2mL EP管を操作する。

二、測定ステップ

1.可視分光光度計/酵素スケール予熱30分以上、波長を700ナノメートル、分光光度計蒸留水をゼロに調整することができる。

2.操作表：（1.5 mLEPチューブに以下の試薬を添加）

三、フィチン酸含有量の計算

1.サンプルタンパク質濃度で計算する

フィチン酸含有量（nmol/mg蛋白質）=ΔA測定C標÷ΔA標準五、様÷（V様×Cpr）=250×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

フィチン酸含有量（nmol/g質量）=ΔA測定C標÷ΔA標準五、上清五、抽出液二)÷（W×V上清÷V抽出液一)

=296.875×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3.液体体積で計算する

フィチン酸含有量（nモル/ミリリットル）=ΔA測定C標÷ΔA標準五、上清五、抽出液二)÷[V液体五、上清÷（V抽出液一五、液体)]

=3265.625×ΔA測定÷ΔA標準

C標識：標準管濃度、250nmol/mL；V様：サンプル体積を加え、0.12ミリリットル; V上清：抽出時の上清体積、0.8ミリリットル；五、抽出液2：抽出液2の体積を加える、0.15ミリリットル；五、抽出液一：添加された抽出液一体積、1mL; Cpr：サンプルタンパク質濃度、mg/mL; V液体：液体サンプルの体積、0.1mL; W：サンプル品質、グラム。

注意事項：

1、もし∆0.010あるいは測定管の吸光値が空白管に近く、サンプル量を増やしてから測定することができる、もし∆A測定がより大きい1、サンプル上清を蒸留水で適宜希釈してから測定することを提案した。同期による計算式の変更に注意してください。

2、サンプルを作動液に添加した後に濁りが発生した場合、サンプル上清を蒸留水で適切に希釈してから測定することを提案する。同期による計算式の変更に注意してください。

3、抽出液1にはタンパク質沈殿剤が含まれているため、上清液はタンパク質濃度測定には使用できない。タンパク質含有量を測定するには、別のサンプルを採取する必要があります。

実験例：

1.玉ねぎサンプル0.1044 gを秤量し、抽出ステップと測定ステップに従って操作し、使用する。（1）：（1）：（2）：（2）：（2）：（2）：（2）：（2）：（2）（2）（2）（296オリフィスプレート測定計算：ΔA測定A.測定A.対照=0.411-0.375=0.036，ΔA標準A.標準A.空白（くうはく）=0.811-0.096=0.715、サンプル品質に基づいて計算：

フィチン酸含有量（nmol/g質量）=296.875×Δ÷ΔA標準÷W=143.18nmol/g質量。

2.小麦粉0.05 gを秤量し、抽出工程と測定工程に従って操作し、96オリフィスプレート測定計算：ΔA測定A.測定A.対照=0.331-0.188=0.143，ΔA標準A.標準A.空白（くうはく）=0.811-0.096=0.715、サンプル品質に基づいて計算：

フィチン酸含有量（nmol/g質量）=296.875×ΔA測定÷ΔA標準÷W=1187.5nmol/g質量。

参考文献：

［1］Senna R、Simonin V、Silva Neto MA C、など。トウモロコシ種子の発芽過程における酸性ホスファターゼ活性の誘導。J

［2］Iqbal TH，Lewis KO，Cooper BT.ヒトおよびラット小腸フィターゼ活性［J］。ガーター、1994、35（9）：1233-1236。

［3］Azeke MA、Egielewa SJ、Ihimire E.発芽がイネ（Oryza sativa）、トウモロコシ（Zea mays）、アワ（Panicum miliaceaum）、コウリャン（sorghum bicolor）及び小麦（Triticum aestivum）フィターゼ活性、フィチン酸塩及び総リン含有量に与える影響［J］。『食品科学と技術雑誌』、2011年。

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