マウスインターロイキン−1 aELISAキット

マウスインターロイキン−1 aELISAキット

背景の紹介：

IL−1には159個のアミノ酸からなるIL−1αと、159個のアミノ酸からなるIL−1αと、両者は異なる遺伝子によってそれぞれ符号化される。ヒトおよびマウスIL−1遺伝子は2番染色体に位置し、いずれも7個のエキソンを含む。IL−1前駆体（ProIL−1）は31 kDaであり、蛋白加水分解酵素による分解により成熟したIL−1分子を形成した。IL−1は異なる属の中で高い相同性を有する。アミノ酸レベルでは、IL−1αとIL−1βはそれぞれ60%〜70%、75%〜78%であり、しかし、同じ属ではIL-1αとIL-1βの相同性は25%しかない。IL-1αとIL-1βの分子量は約17.5 kDaで、等電点はそれぞれ5と7で、相同性は28%で、IL-1αとIL-1βは同じ親和力で同じ細胞表面受容体は、同じ生物学的役割を果たす。

検出原理：

ソラービオ （ソラービオ®)ELISAキットは二重抗体サンドイッチ法に基づく酵素結合免疫吸着検出技術を用いた。抗マウスIL−1 aモノクローナル抗体を酵素スケールプレート上にカプセル化し、勾配希釈の標準品と予備希釈のサンプルをそれぞれ添加し、標準品とサンプル中のマウスIL-1 aは酵素標準板上の包被抗体と十分に結合する、プレート洗浄後にビオチン化抗マウスIL-1 a抗体を添加し、この抗体得はプレート上に抗体で捕捉された標準品とサンプル中のマウスIL-1 aと特異的に結合し、プレートを洗った後にワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識のストレプトアビジンを添加すると、ビオチンとストレプトアビジンが高強度の非共有結合結合を起こす、プレート洗浄後に発色剤基質TMBを添加し、反応孔中のサンプルに異なる濃度のマウスIL-1 aが存在する場合、HRPは無色TMBを異なる濃淡（正相関）の青色物質に変え、終止液を添加すると反応孔は黄色になる、後、λmax=450 nm（OD＝450 nm）で反応孔試料の吸光度（OD）を測定し、試料中のマウスIL−1 a濃度はODに比例し、標準曲線と4パラメータ適合ソフトウェアを描画することで試料中のマウスIL−1 a濃度を算出することができる。

回路図：

注意事項：※※※

• キットは有効期限内に使用し、期限切れの試薬は使用しないでください。
• キットが使用されていない場合は2〜8℃の冷蔵庫に保存し、再溶解しているが使用済みではない標準品は廃棄してください。
• キットを使用する前に室温で30に戻してください min，そして、試薬カートリッジ内の各種成分と調製したサンプルを十分に混合する。
• 試験中に標準品とサンプルは復孔検査を提案し、試薬を添加する順序は*を維持しなければならない。
• 交差汚染を避けるために、試験に1次試験管、銃頭、封板膜（）を使用してください。（：：1）。（2）。（2）。（2）。（2）。（3）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）。（4）※）及び清浄プラスチック容器。.
• 濃縮ビオチン化抗体と濃縮酵素結合物の体積は少なく、輸送中に微量の液体が管壁や瓶に付着する

蓋をして、使用する前に遠心処理（5-10 SでOK）して、管壁の液体を管底部に集中させて、取る時、ピペットで何度も注意して吹き付けてください。

• キット内の濃縮洗浄液と終止液が一般的に使用できるほか、他のソースキットに含まれる試験を使用しないでください

剤は本キットの単一成分の代わりになる。

• 結果が正確であることを保証するためには、検査のたびに標準曲線を作成する必要があります。

セキュリティのヒント：キット中の終止液は酸性溶液であり、作業者は使用時に手袋を着用し、保護に注意してください。操作中も試薬が皮膚と目に接触しないようにし、誤って接触した場合は、大量の清水で洗浄してください。血液サンプル及びその他の体液サンプルを測定する場合は、国家生物実験室の安全防護に関する管理規定に従って実行してください。

キット組成及び保管：

実験器材を持参する（提供せず、代理購入可能）

• 酵素スケール（主波長450 nm、基準波長630 nm）
• 高精度ピペット及び使い捨て吸込ヘッド：0.5-10、2-20、20-200-1000μl
• プレート洗浄機またはボトル洗浄
• 37℃インキュベーションタンク
• 二重蒸発水、脱イオン水、メスシリンダなど
• 希釈用ポリプロピレン試験管

サンプル収集と保管：

• 細胞培養上清：

細胞培地を無菌遠心管に移し、4℃条件下で1000×gで10分間遠心し、その後上清を小EP管に等量分注し、−20℃で保存した（24時間以内に検査して2〜8℃で保存できる）、繰り返し凍結融解を避ける。

• 血清サンプル：

室温で血液が自然に20 min凝固した後、4℃条件下で1000×gで10 min遠心分離し、それから上清を小EP管に等量分注し、-20℃で保存し（24時間以内に検査して2-8℃に入れて保存することができる）、保存中に沈殿があれば、再度遠心分離して、繰り返しの凍結融解を避けてください。

• 血漿サンプル：

全血を抗血凝固剤を含む管に集め、標本の実際の要求に基づいてEDTA、クエン酸ナトリウムまたはヘパリンを抗凝固剤として選択し、20 min混合し、4℃条件下で1000×gで10 min遠心分離した後、上清を小EP管に等量分注し、−20℃で保存した（24時間以内に検査測定して2−8℃に入れて保存することができる）。

※注意：血清血漿サンプルは溶血、高脂血サンプルの使用を避け、検査結果に影響を与えないようにする、サンプル中の標的物の測定濃度が標準品の高い値より高い場合は、サンプルを適切な倍数希釈後に測定し、本実験の前に希釈倍数を決定するための事前実験を行うことを提案します。

試薬準備：

• 試薬の温度戻し：まず実験の30分前に試薬箱を入れて、試料を室温に置いて、濃縮洗浄液は結晶が現れたら、37℃の温浴に入れて結晶が全部溶解するまで入れてください。
• 洗浄液の調製：希釈後の洗浄液の使用体積を事前に計算し、その後、二重蒸水または脱イオン水で20倍濃縮洗浄液を1倍の使用液に希釈し、使い終わっていない濃縮洗浄液を4℃冷蔵庫で保存する。

3.標準品勾配希釈：標準品/サンプル希釈液（SR 1）1 ml凍結乾燥標準品に添加し、15分間静置して*溶解した後に軽く混合し（濃度は2000 pg/ml）、それから以下の濃度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mlで希釈する。再溶解した標準品原液（2000 pg/ml）が使い切れていない場合は廃棄するか、必要に応じて1回の使用量で分注し、それを−20〜−80℃の冷蔵庫に保管し、具体的には下図のようにする。

4.ビオチン化抗体作動液：試験に必要な使用量をあらかじめ計算し、100倍抗体濃縮液を検出希釈液（SR 2）で1倍応用作動液（希釈前に十分に混和）に希釈し、30分以内に反応孔に添加してください。

ビオチン化抗体作動液の具体的なきしゃくほう次のようになります。

5.酵素結合物作動液：毎回の試験に必要な使用量で調製し、酵素結合物希釈液（SR 3）を用いて100倍濃縮酵素結合物を1倍に希釈して作動液（希釈前遠心分離）を使用し、30分以内に使用してください。

酵素結合物作動液の具体的なきしゃくほう次のようになります。

6.洗濯方法：

• 自動洗濯板：酵素標準板の穴の中の液体を振り切って、厚く重ねた吸水紙の上でたたいて乾かして、洗濯液を注入して300 ul/穴で、注と吸出間隔は30秒で、洗濯板は5回。
• 手動洗濯板：酵素スケール板の穴の中の液体を振り切り、厚く重ねた吸水紙の上でたたいて乾かし、洗濯瓶で洗濯液300 ul/穴に入れ、30秒静止した後に酵素スケール板の穴の中の液体を振り切り、厚く重ねた吸水紙の上でたたいて乾かし、5回洗濯した。

検出手順：

結果の判断：

1.酵素スケール450 nm波長を用いたOD値の測定。二波長検出を選択し、基準波長は630 nmである。二波長検出ができない場合は、450 nmのOD測定値から630 nmのOD測定値を減算してください。

2.標準品、サンプルの平均OD値を計算する：各標準品とサンプルのOD値はゼロホールのOD値を減算すべきである

3.標準品濃度を横座標、吸光度OD値を縦座標とし、ソフトウェアを用いて標準曲線を描き、サンプル中のIL-1 a含有量は対応するOD値を通じて標準曲線から相応の濃度を換算することができる。

4.標本OD値が標準曲線の上限より高い場合、適切な希釈を行った後に再検査し、濃度を計算する時に希釈倍数を乗じるべきである。

パラメータキャラクタリゼーション：

1.データ及び標準曲線

本図は参考に供するだけで、当回試験標準品が描いた標準曲線でマウスIL-1 Aのサンプル含有量を計算すべきである

2. 感度：

低検出マウスIL-1 a濃度は15 pg/mlに達し、

20個のゼロ標準品濃度ODの平均値に2つの標準差を加えて、対応する検出可能濃度を計算する。

3. 特異性：

マウスIL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、12、13と反応せず、ラットIL-1βとうはんのう

4. 再現性：

板内、板間変異係数<10%

5. 回収率：

選択した健康マウス血漿、細胞培養上清に3つの異なる濃度レベルのマウスIL−1 aを加え、回収率を計算した。

6. せんけいきしゃく：

選択した4部の健康マウス血漿と細胞培養上清に高濃度マウスIL−1 aをそれぞれ加え、標準曲線動力学の範囲内で希釈し、線形を評価した。

参考文献：

1. グリーンフェダー, S.A. 等. (1995) J. バイオル.化学270:13575.

2. ウェッシェ、H. 等. (1997) J. バイオル。化学272:7727.

3. シムズ、JE等（1994年）クリン。免疫力Immunopatholです。72:9.

4. シムズ、JE等（1993年）プロ。ナトルアカデミック科学アメリカ90:6155.

5.Colotta，F.及びA.Mantovani（1994）「薬理学的傾向」。科学。14:138.

6.Svenson，M.ら（1993）サイトカイン5:427.

7.Giri、J.G.ら（1994）『免疫学雑誌』。153:5802.

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マウスインターロイキン−1 aELISAキット注文の説明：

2、一部の非常用製品は、1－2日前に予約する必要があり、海外先物は3－6週間前に予約する必要がある。
3、一部の製品の価格は納期、ロットなどの要素によって変化し、もし変動があれば注文当日の新価格を基準とする。
4、毎日の注文締切時間は16時ちょうどで、一部の都市は17時ちょうどまで可能で、締切時間を超えて当日出荷できない場合は翌日に出荷を手配する。
5、代金の手続きが終わったら、注文書などを受取人の住所、名前、などと一緒にファックス、メール、などの形式で私たちに知らせてください。

輸送手順：

極低温製品：極低温製品の輸送中にドライアイスを入れて輸送する。ドライアイスで製品を包み、発泡箱で密封し、粘着テープを重ねて発泡箱に接着し、ソレボの箱に入れ、協力宅配便に渡し、安全で迅速で効率的で安心なお客様の手に渡り、製品の性質が安定していることを保証し、あなたの実験のために護衛します。
低温製品：低温製品の輸送中にソレイボ氷嚢を入れて輸送する。事前に氷嚢で製品を包み、発泡箱で密封し、粘着テープで発泡箱を厳密に密封し、ソレボの箱（保温効果が少なくて1週間持続可能）に入れ、それから協力宅配便に渡し、安全で迅速で効率的で安心なお客様の手に入れ、製品の性質が安定していることを保証し、あなたの実験のために護衛します。
常温製品：常温製品の輸送中に氷を入れたり、特殊な包装をしたりする必要はありません。製品は会社の倉庫員が迅速に配送し、正確で迅速で効率的な宅配便は製品が迅速にあなたの手に届くことを保証します。