One Step Seamless Cloning Kitシームレスクローニング

ノボライドOne Step Seamless Cloning Kitシームレスクローニング

One Step Seamless Cloning Kit (シングルクリップ)

ディレクトリ番号：42111

包装量：

製品保管：-20°C保存、複数回の繰り返し凍結融解を避ける

具体的な製品のパラメータは製品説明書を受け取ったパラメータを基準とする

製品の説明：ワンステップシームレスクローニングキットは、テトラヨードメチルアデノゲンリガーゼは、ベクターと目的フラグメントの酵素切断部位に制限されることなく、重複フラグメントを直接再結合する方法であり、特殊な酵素組み合わせを用いて任意の方法を線形化したベクターとその両端に16-25bpオーバーラップ領域のポリメラーゼ連鎖反応フラグメント指向性再結合接続、30分以内に実現A.末端または平末端ポリメラーゼ連鎖反応生成物フラグメントは、担体の任意の部位に効率的に方向転換してシームレスにクローニングされる。

製品特徴：

1. 30分に1つ50 bp−15 kbポリメラーゼ鎖反応増幅フラグメント（フラットA.末端）任意のベクターの任意の位置にクローンを挿入します。

2.非ベクターおよび挿入フラグメント酵素の切断部位の有用性平和端/粘性末端的限を作成し、任意の場所でクローンを作成できます。

3. 挿入点に不要な塩基配列を導入することはありません。

4. 95%以上です。

ワンステップシームレスクローニングキットの原理概略図：

線形化ベクターと挿入デオキシリボ核酸フラグメントの作成：

A.：線形化担体の製造

(1).酵素切断源：酵素切断により得られた線形担体は、平末端または粘端、単酵素切断または二酵素切断のいずれでもよく、酵素切断後にゲル回収する。

デオキシリボ核酸リガーゼは、ベクター自己連結反応を起こさない。したがって、モノ酵素カット方式で製造された線形化ベクターであっても末端脱リン酸処理を行う必要はない。組換え産物の転化後に出現した偽陽性クローン(挿入クリップなし)酵素がquanを切断できない線形化されていない環状ベクターの転化によって形成された。酵素カット後のゲル回収は、このような非線形化ベクターの割合を最もdi程度に下げることができることをお勧めします。

(2).逆方向ポリメラーゼ連鎖反応ハイファイを推奨デオキシリボ核酸ポリメラーゼ（商品番号：P517-05またはP812-05）を調製し、増幅ストリップが単一であればポリメラーゼ連鎖反応製品精製（貨物番号：DC012-50）で担体を取得し、そうでなければゲル回収（品番：DC011-50）担体を得る。

注意：逆方向ポリメラーゼ連鎖反応のプラスミドテンプレートも非線形化ベクターであり、偽陽性クローン（挿入フラグメントなし）を引き起こす可能性があるため、このため、「プラスミドテンプレート」は、非線形化ベクターである。（提供/CRI）。（提供/CRI）。）。（提供/CRポリメラーゼ連鎖反応ソース線形担体（ポリメラーゼ連鎖反応精製前の使用Dpn Iインターロイナーゼがプラスミドテンプレートを消化することで、背景を下げ、陽性率を高めることができる。しかし、一般的には、このような線形化されていない担体の割合を最もdiに下げるのに十分なゲル回収が行われているため、逆方向ポリメラーゼ連鎖反応供給源の線形化担体はゲル回収もお勧めします。

B:挿入[そうにゅう]デオキシリボ核酸フラグメントの調製

(1).ワンステップシームレスクローニングプライマー設計の基本原則は、プライマー5’エンドは線形化クローンベクターのエンド相同配列を導入し、挿入フラグメント増幅産物5’和3’（16 bp～20 bp）。

(2).挿入フラグメントプライマー設計：クローンプライマーには、挿入フラグメント特異的プライマー配列と重複配列が含まれる。

クローン順方向プライマー(5’-3’)：リニアキャリア順方向16-25ニュー台湾ドルオーバーラップ領域シーケンス(3’末端計算)+挿入フラグメント順方向特異プライマー配列（18-25ニュー台湾ドル）

クローン逆プライマー(5’-3’)：リニアキャリアの反転16-25ニュー台湾ドル(3’末端計算)+挿入フラグメント逆特異プライマー配列（18-25ニュー台湾ドル）

注意：重複領域の塩基数は少なくとも16 bpを選択し、複数のオーバーラップ領域間のthuliumカエデ値は一貫性を保ち、＞60°C（AT対＝2°C、GC対＝4°C）を選択しないと、要求に合致するまで塩基の数を延長することができる。

線形キャリアの末端の構造（5’が際立ち、3’突出、平末端）、プライマー設計も3次のような場合があります。

ポリメラーゼ連鎖反応）が異なり、上記3種類の末端構造の2つまたは2つの任意の組み合わせであってもよく、挿入断片特異性プライマー設計の原則は一般プライマー設計の原則に従えばよい。

増幅プライマーのアニール温度を計算する際には、遺伝子特異的増幅配列のthuliumカエデ

(3).酵素の選択：高忠実度の使用を推奨するデオキシリボ核酸ポリメラーゼまたはPCR混合物（貨物番号：P517-05または第814-05ページ）。

(4).

(5).挿入クリップの精製

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） 可选：如果片段来源于质粒模板，且该质粒与重组载体具有相同抗性，纯化前用Dpn Iインターロイナーゼはプラスミドテンプレートを消化し、背景を下げ、陽性率を高めることができる。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） フラグメントが単一の場合は、ポリメラーゼ連鎖反応製品精製キット（品番：DC012-100）フラグメントを精製する。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） 非特異的な増幅がある場合は、接着剤でキットを回収することをお勧めします（品番：DC011-100）フラグメントを回収します。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） この方法を用いてクローンを作成し、ベクターを線形化するために用いられる酵素切開部位はスプライシングの際に欠落することがあり、もし酵素切開部位に厳しい要求がある場合は、酵素切開部位の選択に注意することを提案し、必要な場合は正逆クローンプライマーの重複領域配列と特異遺伝子配列の間

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） 組換えプラスミドがタンパク質発現に使用される場合、プライマー設計時にコードボックス、タンパク質発現、精製に必要な配列（プロモーター、RBS配列、開始コドン、終了コドン、タンパク質ラベルなど）は破壊されない。

順方向プライマー設計例（経済研究I酵素切開）：

上図のように、担体は経済I酵素切開、形成5’突出端：

上記の設計原則に基づいて、3’端が計算を開始し、逆算する16bp-25bp（本例では20 bp末端に同じ配列を重ね)、目的の断片特異プライマー配列の前に加えればよい。オーバーラップ領域のthuliumカエデ値は一貫性があり、＞60°C（AT対＝2°C、GC対＝4°C）。

5'gagctagggttgggggnnnnnnnnnnn3'

注：上記プライマーの設計によりクローン接続が完了した後、経済研究I酵素カットポイントが失われます（酵素カットポイントは保持されません）。

保存が必要な場合経済研究I酵素カット部位、ベクター末端に必要20 bp重複配列と目的フラグメント特異プライマー配列との間の補完欠損経済研究I識別ビットシーケンスaattc の、クローン接続が完了したら、経済研究I酵素カット部位は依然として存在する（酵素カット部位を保持する）。

具体的には、5' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNN3'

逆プライマー設計例（シンド3世酵素切開）：

上図のように、担体はシンド3世酵素切開、形成5’突出端：

上記の設計原則に基づいて、3’端が計算を開始し、逆算する16bp-25bp（本例では20 bp末端に同じ配列を重ね)、目的の断片特異プライマー配列の前に加えればよい。オーバーラップ領域のthuliumカエデ値は一貫性があり、＞60°C（AT対＝2°C、GC対＝4°C）。

逆プライマーは、具体的には次のとおりです。5'ctgccatcggatcgttcgannnnnnnnnnnn 3'

注：上記プライマーの設計によりクローン接続が完了した後、シンド3世

保存が必要な場合シンド3世酵素カット部位、ベクター末端に必要20 bp重複配列と目的フラグメント特異プライマー配列との間の補完欠損シンド3世識別ビットシーケンスagctt，シンド3世酵素カット部位は依然として存在する（酵素カット部位を保持する）。

具体的には、5' CTGCCATCGGATCGTCGCA第3期

シームレスクローン反応の操作手順：

注：2×ワンステップクローン組み合わせ結合強化剤含有PEG粘り気が強く、冷蔵庫から出すと温度が低い時はもっと粘り気があり、手のひらで凍らせて数分温度を上げると粘度を下げることができ（品質に影響しない）、軽く弾いて混ぜて、瞬間的に遠心分離して管底に集めることができる。

1. 以下の表に従って反応系を構築する（使用可能ポリメラーゼ連鎖反応チューブを室温で調製）

* キャリア一般用20-50 ng、挿入フラグメントと担体のモル比は2:1-3:1間が最適挿入クリップがより小さい場合200ベーシスポイント、挿入断片と担体のモル比用5:1。

2. 軽く混ぜて、50°C反応15分（ポリメラーゼ連鎖反応計器上で行い)、反応が終わったら、ポリメラーゼ連鎖反応-20°C。短いクリップ、たとえば100bp-1kbただ必要15分で十分な形質転換子を得ることができ、長い断片の結合は、反応時間を延長することができる60分です。

3. 取る5μl反応生成物は、感受性細胞の説明書に従って形質転換される（形質転換子が少ない場合、すべての生成物を形質転換し、すべての形質転換液をプレートに塗布することができる）。

陽性クローンの同定：

ポリメラーゼ連鎖反応鑑定、プラスミド抽出（商品番号31013-100）を用いて制限的インターロイナーゼ同定または配列決定同定を行った。

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