ピルビン酸脱水素酵素（PDH）活性検出キット微量法

ピルビン酸脱水素酵素（光端機 びりょうほう

注意：本製品の試薬は変動しているので、注意して厳格にこの説明書に従って操作してください。

商品番号：BC0385

仕様：100トン/96秒

製品構成：使用前に試薬の体積と瓶内の体積が一致しているかどうかを真剣にチェックして、疑問があれば直ちにソレボスタッフに連絡してください。

ピルビン酸脱水素酵素（PDH）活性検出キット微量法

ピルビン酸脱水素酵素（PDH）活性検出キット微量法

溶液の調製：

1. 試薬二：揮発性試薬のために、使用後はできるだけ早く密封し、-20℃保存します。

2. 作動液の調製：臨用前把5.75mL試薬4、試薬1本5、0.45mL試薬六、1.75mL試薬7を試薬3に移して混合溶解して使用する（共15.45ミリリットル、約85T）;使いきれない試薬-20℃分装保存、保存可能4週。

製品の説明：

光端機（EC 4.1.1.1）動物、植物、微生物及び培養細胞に広く存在し、ピルビン酸脱水素酵素複合体である（PDHC）ピルビン酸酸化脱カルボキシルを触媒する律速酵素、ピルビン酸脱梭を触媒するを選択し、酵母分解とトリカルボン酸サイクルを連結する。

光端機ピルビン酸脱水素を触媒し、同時に還元する2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノール（2,6-DCPIP）を使用することにより、605ナノメートル光吸収の減少。

ピルビン酸+チアミンピロリン酸塩ヒドロキシエチルチアミンピロリン酸

ジクロロフェノール（605 nm）＋ヒドロキシエチルチアミンピロリン酸塩還元ジクロロフェノール

注意：実験前に選択を提案する2-3サンプル吸光値が測定範囲内にない場合は、希釈またはサンプル量を増やして測定することをお勧めします。

持参する機器と用品：

可視分光光度計/酵素スケール、水浴釜、卓上遠心分離機、可変ピペット、微量ガラス比色皿/96オリフィスプレート、すり鉢/ホモジナイザー、氷、蒸留水。

操作手順：

一、サンプル処理（測定すべきサンプル量を適切に調整でき、具体的な割合は文献を参照できる）

1. 組織：秤取約0.1g組織する1mL試薬一和10μL試薬2、氷浴ホモジナイザーまたはすり鉢ホモジナイズで十分に研磨し、4℃11000 g遠心10分、上清を取って、氷を張って待つ測定。

2. 細胞または細菌サンプル：まず収集する500万細胞または細菌を遠心管内に入れ、遠心分離後に清を捨てる。あとで参加1ミリリットル試薬一和10μL試薬二、氷浴超音波破砕細菌（パワー200ワット、超音波3秒、間隔7秒、合計時間5分）；そして11000g，4℃、遠心分離10分，

上清を取って氷の上に置いて測定する。

3. けっしょう：直接検出。溶液に濁りがあれば遠心分離して上清に行って測定する。

二、測定ステップ

1、表示分光光度計または酵素スケール予熱30分以上、波長を605ナノメートル、分光光度計蒸留水をゼロに調整する。

2、サンプルごとに必要180マイクロリットル作動液、実験に必要な一定量の作動液を取り出して37℃（哺乳動物）または25℃（その他の種）水浴釜の中水浴10分。

3、空管：微量比色皿または96180マイクロリットル作動液と10μL水、混合、即時記録605ナノメートル処10s処きゅうこうか素晴らしい和1分10秒s後の吸光値A 2レベル、計算＃ケイサン＃ΔA空白（くうはく）=A1-A2。ブランクチューブは測定するだけ1-2次。

4、測定管：微量比色皿又は96オリフィスプレートに追加180マイクロリットル工作液和10μLサンプル605ナノメートル処10s処きゅうこうかA 3用紙和1分10秒s後の吸光値A4、計算＃ケイサン＃ΔA測定=A3-A4。

三、光端機かっせいけいさん

一微量比色皿を用いて測定した計算式は以下の通りである

1. サンプルタンパク質濃度で計算

単位の定義：毎ミリグラム反応系における組織蛋白の毎分消費1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機活性（U/mg蛋白質）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷（ε×d）五、×10⁹]÷（Cpr×V様)÷T

=904.762×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷Cpr

2.

単位の定義：毎グラム組織は反応系中で毎分消費する1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機活性（U/g品質）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷（ε×d）五、反総×10⁹]÷（V様÷Vサンプル×W）÷T

=913.81×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷W

3. 細菌または細胞数で計算する

11分間に1万個の細菌または細胞が反応系で消費される1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機活性（U/10⁴細胞）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）五、反総÷（ε×d）×10⁹]÷（V様÷Vサンプル×500）÷T

=1.828×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)

4.

単位の定義：毎ミリリットル液体反応系において1分あたりの消費1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機かっせい（単位/ミリリットル）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）五、反総÷（ε×d）×10⁹]÷V様÷T

=904.762×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)

五、反総：反応系の総体積、1.9×10^-4L；ε：2,6-ジクロロインドールフェノールモルの消光係数、2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿の光径、1cm；五、サンプル：サンプル体積を加え、0.01ミリリットル；五、サンプル合計：試薬1と試薬2体積を添加し、1.01mL；T：反応時間、1分；心肺蘇生術：サンプルタンパク質濃度、mg/mL；W：サンプル品質、グラム；500：細菌または細胞の総数、500万です。

b用いる96オリフィスプレート測定の計算式は以下の通りである

1．サンプルタンパク質濃度で計算

単位の定義：毎ミリグラム反応系における組織蛋白の毎分消費1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

光端機活性（U/mg蛋白質）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）五、反総÷（ε×d）×10⁹]÷（Cpr×V様)÷T

=1809.524×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷Cpr

2．サンプル品質で計算

単位の定義：毎グラム組織は反応系中で毎分消費する1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機活性（U/g品質）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）五、反総÷（ε×d）×10⁹]÷（V様÷Vサンプル×W）÷T

=1827.62×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷W

3．細菌または細胞数で計算する

11分間に1万個の細菌または細胞が反応系で消費される1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機活性（U/10⁴細胞）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）五、反総÷（ε×d）×10⁹]÷（V様÷Vサンプル×500）÷T

=3.655×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)

4．サンプル体積で計算

単位の定義：毎ミリリットル液体反応系において1分あたりの消費1nmol 2,6-ジクロロフェノールインディゴフェノールは酵素活性単位と定義される。

光端機かっせい（単位/ミリリットル）=[（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）五、反総÷（ε×d）×10⁹]÷V様÷T

=1809.524×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)

五、反総：反応系の総体積、1.9×10^-4L；ε：2,6-ジクロロインドールフェノールモルの消光係数、2.1×10⁴L/mol/cm；d：96孔板の光径、0.5 cm；五、サンプル：サンプル体積を加え、0.01ミリリットル；五、サンプル合計：試薬1と試薬2体積を添加し、1.01mL；T：反応時間、1分；心肺蘇生術：サンプルタンパク質濃度、mg/mL；W：サンプル品質、グラム；500：細菌または細胞の総数、500万です。

注意事項：

1、測定中にすべてのサンプルを氷の上に置き、2変性と不活性化を防ぐために、時間内に測定した。

2、測定管のΔA値は0.01-0.25間、測定管のΔAより大きい値0.25、サンプルを希釈する必要があります。測定管のΔA値小に0.01、サンプル量を増やして再測定し、計算式を同時に修正することに注意しなければならない。

3、1mg/mL）があるため、サンプルタンパク質濃度を測定する際には減算する必要がある試薬1の蛋白質含有量を測定した。

実験例：

1、取る0.1 gマウスの肝臓加入1mL試薬一和10μL試薬2、氷浴ホモジナイザーまたはすり鉢ホモジナイズで十分に研磨し、4℃、11,000 g遠心10分、上澄みを取って氷上に置き、測定手順に従って操作し、微量石英比色皿測定する計算ΔA測定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923，ΔA空白（くうはく）=A1-A2=1.3325-1.3314=0.0011、サンプル品質に基づいて酵素の生存率を計算する：

光端機かっせい（U/g品質)=913.81×（ΔA測定-ΔA空白（くうはく）)÷W=1747 U/g品質。

関連発表文献：

[1]彭勝、王勇、周勇、など。希少人参サポニンは代謝柔軟性を調節することで脂質過負荷誘導心筋インスリン抵抗を改善する[J]。植物医学、2019、58：152745。

参考文献：

[1]Guitart M、Andreu A L、Garc瘻A-Arumi E、等.FATP 1はミトコンドリアに位置し、骨格筋管中のピルビン酸脱水素酵素活性を増強する[J]。ミトコンドリア、2009、9（4）：266-272。

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