蛋白双方向電気泳動実験サービス

一、蛋白双方向電気泳動実験サービス実験技術の概要

一般的な実験手順は、抗原タンパク質混合物を双方向電気泳動により分離した後、ゲルタンパク質を支持膜に転写し、抗体ハイブリダイゼーションにより発色させる。2 D-WB技術は抗原などの電気点や分子量に発生する微小な変化を検出することができ、蛋白質翻訳後の修飾の研究に良好な応用がある、一方、2 D-WB結合質量分析鑑定技術は、タンパク質混合物から免疫原性の強い抗原を見つけることができる。

二、蛋白双方向電気泳動実験サービス概要

2 D-WBは双方向電気泳動と伝統的なwestern blotを結合した技術である。一般的な実験手順は、抗原タンパク質混合物を双方向電気泳動により分離した後、ゲルタンパク質を支持膜に転写し、抗体ハイブリダイゼーションにより発色させる。2 D-WB技術は抗原などの電気点や分子量に発生する微小な変化を検出することができ、蛋白質翻訳後の修飾の研究に良好な応用がある、一方、2 D-WB結合質量分析鑑定技術は、タンパク質混合物から免疫原性の強い抗原を見つけることができる。

三、サービス内容

2、双方向電気泳動、

3、転膜、閉鎖、インキュベーション、イメージングを表示する。

四、実験操作フロー

1、第--項電気泳動（IEF）、ゴム条平衡、第二項電気泳動SDS-APGE.

2、第二項電気泳動終了後、ゲルを取り出して転膜を行い、転膜方法は湿式転移と半乾式転移を選択することができる。一般的な膜はNC膜とPVDF膜である。

3、閉鎖、5%脱脂粉乳または5%BSAを1時間（室温）または一晩（4度）閉鎖する。

4、一抗抱育、抗体説明書に基づいて抱育時間を選択し、通常の抱育条件は室温で1時間或いは4度一晩、一抗抱育後に膜を取り出す

TBST洗浄3回、毎回5分間。

5、二抗孵化：一抗に基づいて適切な二抗（抗マウス、抗ヒト、抗ウサギなど）を選択し、室温で1時間孵化した後、膜TBSTを取り出して3回洗浄し、毎回5分間。

6、現像：A、B基質を比例希釈混合台で均一にした後、膜上に滴下し、暗室でフィルムを膜上に置き、打錠ニップを被せ、一定時間露光した後、フィルムを現像液中に入れて現像し、はっきりしたタンパク質ストライプが現れるまで、清水ですすいでから定着液中で定着し、露光時間は総合台でタンパク質のサンプル量、抗体希釈濃度、抗体インキュベーション時間などの要素を考慮する必要がある。

7、定着後、フィルムを洗浄し、乾燥し、マーカーを標定し、画像をスキャンし、2 D Western blot画像を分析する。

サンプル送付の心得、2 D Western blot技術サービスが順調に進むことを保証するために、サンプル送付は以下の要求を満たす必要がある：

一抗（研謹会社に代理購入することができる）。

2、輸送要求：ドライアイスまたは液体窒素包装で送る。

注：サンプルは各種汚染と繰り返し凍結融解を避けるべきである。

五、技術サービス報告内容

1、蛋白質定量結果及び電気泳動サンプリング量；

2、原始フィルム、電子写真及び画像分析結果、

3、2 D Western blotの完全な実験報告書、実験手順、使用機器、試薬などを含む。

附：2 D Western blot実験手順

1、2 D Western blot蛋白質サンプルの調製、調製の主な原則はできるだけすべての蛋白質を溶解し、蛋白質と蛋白質間の相互作用を破壊し、各種干渉物質を回避し、サンプル調製とIEFの互換性などである。

3、第二項電気泳動終了後、ゲルを取り出して転膜を行い、転膜方法は湿式転移と半乾式転移を選択することができる。一般的な膜はNC膜とPVDF膜である。

4、閉鎖、5%脱脂粉乳または5%BSAを1時間（室温）または一晩（4度）閉鎖する。

5、−抗インキュベーション、抗体説明書に基づいてインキュベーション時間を選択し、通常のインキュベーション条件は室温で1時間または4度一晩、一抗インキュベーション後に膜TBSTを取り出して3回洗浄し、毎回5分間。

6、二抗孵化：−抗に基づいて適切な二抗（抗マウス、抗ヒト抗ウサギなど）を選択し、室温で1時間孵化した後、膜TBSTを取り出して3回洗浄し、毎回5分間。

7、現像：A、B基質を比例希釈混合して均一に滴下、暗室でフィルムをフィルム上に置き、打錠ニップをかぶせ、一定時間露光後にフィルムを現像液中に入れて現像し、はっきりした蛋白質ストライプが現れるまで、清水ですすいでから定着液中で定着、露光時間は蛋白質の総合的な考慮が必要である。サンプリング量、抗体希釈濃度、抗体培養時間などの要素。

8、定着後、フィルムを洗浄し、乾燥し、マーカーを標定し、画像をスキャンし、2 D Western blot画像を分析する。

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