pBLUE−T Simpleベクターの高速クローニングキットT 4の原理

pBLUE-Tシンプルベクター高速クローニングキット

pBLUE−T Simpleベクターの高速クローニングキットT 4の原理

ディレクトリ番号：42119

キット組成、保管、安定性：

−20℃で保存し、6ヶ月以内に使用効果に影響しない。

製品紹介：

pBLUE−T Simple Vectorは、高効率クローンPCR生成物（TA Cloning）の専用ベクターである。このベクターはpBlueScriptII SK(+)プラスミドを改築したもので、従来のTベクターECOR V切開後のT添加方法とは異なり、pSURE-T SimpleはpBlueScriptII SK(+)を改造することにより、元のpBlueScriptII SK(+)マルチクローニング部位にXcm I酵素切開を導入した後、元のマルチクローニング部位の両側の3’末端に直接未対合のT塩基を産生させるため、より高い組換え効率がある。同時に、pBlueScriptII SK（＋）ベクター上のポリクローナル酵素カット部位を除去し、PCR増幅プライマー上に適切な酵素カット部位を導入する必要がある。この時、PCR増幅プライマーに導入された酵素カット部位を用いてDNA酵素カットを行うと、酵素カット反応はTベクター上の他のポリクローナル酵素カット部位上の制限酵素の影響を受けず、酵素カット効率を大幅に向上させ、アク隆起パワーを増加させることができる。また、当社のキャリア接続システムには背景が低く（青斑は10%未満）、再結合率が高い（白斑の90%以上は挿入断片がある）、迅速に接続できるなどの特徴がある。本明細書の最後には、ポリクローナル酵素の切断部位における配列がわずかに異なるだけで、pBLUE−T Simpleベクターに関する技術資料が記載されている。

シーケンシングの推奨採用M 13汎用シーケンシングプライマーとT 3プロモータープライマー（後のスペクトルを参照）
操作手順：
1.接続反応の準備

PCR生成物を精製するかどうかは、増幅生成物の品質に依存する。PCR生成物が非常に清潔であれば、精製せずに結合反応を行うことができる。しかし、プラスミドをテンプレートとするPCR生成物であれば精製しなければならず、テンプレートプラスミドも白斑を形成する可能性がある。当社製DNA産物迅速精製回収キットは、70 bp以上のDNA断片を良好に回収することができる。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNAポリメラーゼを増幅したPCR生成物は、その末端に突出した3’を持っている-A。3’を有する-A末端のPCR生成物は、pBLUE−T Simpleベクターを用いてクローン結合を直接行うことができる。3’を有する®5’エキソザイム活性DNAポリメラーゼ（ハイファイ酵素）増幅PCR生成物は平末端であり、この平末端PCR生成物をクローニングするには、まず3’­-端加A作業。

2. 一般的な接続反応：

1) 標準的な10米l連結反応系に1を加える米L 30%のpblue-tはシンプル米l PCR产物(在通常状况下，没有必要对PCR产物进行精确定量，一般PCR产物与载体的摩尔比优化至2:1~10:1就可以得到良好结果，推荐3:1)、1米l 10´ligation Bufferと0.5-1米l（2.5-5 Weiss Units）のT 4 DNA Ligase、残りは水で補う。反応は以下のシステムで行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2) 16℃で一晩接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

一般に16℃で一晩接続することを推奨する（10米l系標準リガーゼ量は2.5 Weiss Unitsでよい）、最も多い形質転換子を得ることができる。しかし、本システムに含まれるPEG Enhancerは接続効率を数倍に高めることができ、高リガーゼ量の場合（10米l系推奨リガーゼ量は5 Weiss Units）16℃で30分間接続すれば一般研究の要求に達することができる。

3) 氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。

3. 高速接続反応：

1) 反応は以下のシステムで行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2) 22℃で5〜10分間接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

2 ´Quick Ligation Bufferには最適化された高速接続成分がすべて含まれており、通常は22℃で10分間接続することが推奨されています（10米l系リガーゼ量は5 Weiss Unitsであり、長断片接続は30分まで延長できる）一般的に満足できる結果を得ることができる。また本システムは16℃で30分間接続することもできる（10米l系リガーゼ量は5 Weiss Units）で一般研究の要求に達することができる。

3) 氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。

4. 変換:

に 50-100米l感受性細胞を氷の上に置き、wanを全解凍した後、軽く何回かはたいて細胞を均一に懸濁させた。

に 4-5を追加米l接続液（体積が感受性細胞体積の1/10を超えない限り、すべて添加することができる）、軽く混合する。氷の上に30分置く。42℃の水浴で90秒間熱刺激した。氷の上に2 ~ 3分置く。

に プラス500米LBまたはSOC培地（抗生物質を含まない）、37℃150 rpm振動培養60分間。

に 200米l細菌を事前に16米l 50mg/ml IPTG和40米l 20 mg/ml X−galコーティングアンモニアベンジル青カビス平板上。

塗布細菌の使用量は結合の効率及び受容体細胞の受容率に応じて適切に調整し、もし予想されるクローンが少ない場合、遠心分離（4000 rpm、2分）後に培養液の一部を吸引除去し、適量の培地懸濁菌体を残した後、すべて又は適量を1つの平板に塗布することができる（塗布した残りの菌液は4度に保存し、2日目に転化菌数が少ない場合、残りの菌液をすべて新しい培養板に塗布することができる）。

に プレートを37℃で1時間順方向に放置して過剰な液体を吸収し、その後一晩逆さまに培養した。

5 フィルタ:

1). 形質転換子の青白フィルタ：

外来DNA断片がpBLUE−T Simpleに挿入されると、外来DNAの核酸配列の存在によりLacZ遺伝子のコードが変化し、その生成物に影響を与えるbガラクトシダーゼ一フラグメントが活性であるため、組換えクローンはX-gal/IPTG平板上で青色ではなく白色に見える。場合によっては挿入フラグメントがlacZ遺伝子読取コードボックスに影響を与えなかったり、挿入フラグメントが小さすぎたりして、この場合コロニー（組換えクローン）は水色を呈したり、コロニー中心に淡青斑点を呈し、外周は白色（魚眼状青斑fish eye）を呈したりする。IPTG/X-galプレート上に成長させた白色コロニーまたは水色コロニーを選択し、楊枝を用いてアンピシリルペニシス含有液体培地に挑み、37℃で一晩培養した。

2). 形質転換子の同定：

一 上記培養した白色コロニーの菌液を用いてプラスミドを抽出し、挿入フラグメントに含まれる酵素切除部位酵素を用いて切除し、アガロースゲル電気泳動によりフラグメントの大きさを検査し、目的フラグメントを含有するかどうかを確定した。

b 白色コロニーを採取して直接PCR検査を行う

c 用T3启动子引物或M13通用测序引物测序来确定是否含有目的克隆。

に 結合反応に必要なPCR生成物の量をどのように計算しますか。

一般的なPCR生成物と担体のモル比は2：1〜10：1（推奨3：1）に最適化すれば良好な結果が得られ、以下の式を採用することができる：

［添加担体の量（ng）×挿入断片の大きさ（kb）÷担体の大きさ（kb）］×挿入断片と担体のモル比＝挿入断片の量（ng）例えば、挿入断片と担体の結合のモル比は3：1であり、例えば、結合反応に担体40 ngを添加し、挿入断片の大きさは1000 bpであり、この時に添加すべき挿入断片の量は［40 ng担体×1 kb挿入断片÷2.928 kb担体］×3／1＝40.1 ngである。

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