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アドレス
北京市海淀区馬連窪北路128号百草園3号棟2ユニット503
製品分類
北京ノボラード科技有限公司
概要
ゼロバックグラウンド平末端高速接続キットは優れたzi殺遺伝子陽性選択クローンシステムであり、平末端PCR生成物と平末端を有する任意のDNA断片を効率的にクローンすることができる。このキットはリン酸化または非リン酸化DNA断片のいずれにも有効である。$r$nゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキットT 4の原理
製品詳細
ゼロ鈍ゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキット
ゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキットT 4の原理
ディレクトリ番号：42018
キット組成、保管、安定性：
キット組成 |
20回（42018-20） |
40回（42018-40） |
Pzero鈍感ベクトル（40/米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
20 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
40 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
1 Kbp制御（40 ng/米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
5 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
5 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
2 ´高速結紮緩衝液 |
100 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
200 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
Q 4 DNAリガーゼ、5 U/米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
20 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
40 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
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pZERO Blunt 順方向配列決定プライマー（10µM） |
100 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
200 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
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pZERO Blunt 逆配列決定プライマー（10µM） |
100 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
200 米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
−20℃で保存し、6ヶ月以内に使用効果に影響しない。
v 製品紹介：
ゼロバックグラウンド平末端高速接続キットは優れたzi殺遺伝子陽性選択クローンシステムであり、平末端PCR生成物と平末端を有する任意のDNA断片を効率的にクローンすることができる。このキットはリン酸化または非リン酸化DNA断片のいずれにも有効である。陽性選択ベクターと挿入フラグメント接続はわずか5分で95%を超える陽性組換えクローンを得ることができる。修正活性を有するポリメラーゼ（例えば：Pfu polymerase）によって増幅された平末端PCR生成物は、クローンベクターに直接結合することができる。連結生成物は、一般的に使用される大腸菌株を直接変換することができる。
キットは、新規なzi殺遺伝子陽性選択クローンベクターpZERO−BLuntを提供する。このベクターには致死的なzi殺し遺伝子（ポリクローナル部位を含む）が含まれており、ベクターと断片の接続に成功した場合、zi殺し遺伝子は正確に発現できず、組換え子を含む細胞は正常に成長することができる。ベクターとフラグメントの結合が成功しない場合、ベクター自己結合後のzi遺伝子は正しく発現し、自己連空ベクターを含む細胞は生存できない、すなわち「ゼロZERO」背景。この陽性スクリーニング戦略は青白斑スクリーニングを必要とせず、クローンスクリーニングプロセスを大幅に加速させた。
酵素切除図と挿入断片遺伝子操作を容易にするために、pZERO-Bluntクローンベクターのマルチクローン部位の両側にそれぞれ1つのBglII識別配列が含まれている。また、この担体はT 7プロモーターを含み、体内または体外転写、挿入フラグメントの配列決定などの研究に用いることができる。
操作手順：
1. 接続反応の準備：
平末端PCR生成物または酵素カット後の平末端断片はアガロースゲル電気泳動により分離回収することができる（長波紫外光下カットまたは可視光透過カットを用いてDNA損傷による接続失敗を回避する）。担体に対するモル比は3：1である。当社製DNA産物迅速精製回収キットは、70 bp以上のDNA断片を良好に回収することができる。
2. 高速接続反応：
1) 標準的な10米l連結反応系に1を加える米L 40，<NUM>pzero鈍Chの＃1米l PCR生成物（通常の状況では、PCR生成物を正確に定量する必要はなく、一般的なPCR生成物と担体のモル比を1：1 ~ 10：1に最適化すれば良好な結果が得られ、3：1を推薦し、付録を参照）、5米l 2´Quick ligation Bufferと0.9米lのT 4 DNA Ligase、残りは滅菌水で補う。
反応は以下のシステムで行った：
5米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
2 ´ |
1米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
pZERO-BLunt担体 |
十、米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
精製後のPCR生成物／または1米l 1000 bp制御 |
Y米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
滅菌水 |
0.9米l（Weiss単位5個／米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
Q 4 DNAリガーゼ |
さいしゅうたいせき |
10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） |
一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。
2) 22℃で5〜10分間接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。
通常、22℃で5〜10分間接続することが推奨され、>3 kbの長い断片接続は30分間に延長することができる。30分を超えることは推奨されず、超えると形質転換子の数が減少する可能性がある。
3) 氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。
3. 変換:
1) 100米l感受性細胞を氷の上に置き、wanを全解凍した後、軽く何回かはたいて細胞を均一に懸濁させた。
2) 4-5を追加米l結合液（結合液の体積が感受性細胞の体積の1/10を超えない限り、すべて添加することができる）、軽く混合する。氷の上に30分置く。
3) 42℃の水浴で90秒間熱刺激した。氷の上に2 ~ 3分置く。
4) プラス500米LBまたはSOC培地（抗生物質を含まない）、37℃150 rpm振動培養60分間。
5) 200米lアンモニアベンジル青カビス（100米g/ml）平板上。
塗布細菌の使用量は結合の効率及び受容体細胞の受容率に応じて適切に調整し、もし予想されるクローンが少ない場合、遠心分離（4000 rpm、2分）後に培養液の一部を吸引除去し、適量の培地懸濁菌体を残した後、すべて又は適量を1つの平板に塗布することができる（塗布した残りの菌液は4度に保存し、2日目に転化菌数が少ない場合、残りの菌液をすべて新しい培養板に塗布することができる）。
6) プレートを37℃で1時間順方向に放置して過剰な液体を吸収し、その後一晩逆さまに培養した。
5 フィルタ:
1). 通常検査：得られたコロニーをLB 1-5 ml（最終濃度100を含む米g/mlのアンピシリルペニシス）培地、37℃揺床振動培養一晩、菌種保存後プラスミドを抽出し、PCRまたは酵素切断方法を用いて挿入フラグメントが正しいかどうかを鑑定した。
2). 迅速検査：コロニーを採取して直接PCR検査を行う（分子クローニング第3版を参照するか、当社のCV 05-汎用T担体コロニーPCR鑑定キット明細書を参照することができる）。
3).
本キットには配列決定プライマー（コロニーPCR同定プライマーにも使用）を持参する：
順方向配列決定プライマー、23-mer |
5フィート～3フィート |
逆配列決定プライマー、24−mer |
5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' |
v 付録：
に 結合反応に必要なPCR生成物の量をどのように計算しますか。
一般的なPCR生成物と担体のモル比は1：1〜10：1（推奨3：1）に最適化すれば良好な結果が得られ、以下の式を採用することができる：
［添加担体の量（ng）×挿入断片の大きさ（kb）÷担体の大きさ（kb）］×挿入断片と担体のモル比＝挿入断片の量（ng）例えば、挿入断片と担体の結合のモル比は3：1であり、例えば、結合反応に担体40 ngを添加し、挿入断片の大きさは500 bpであり、この時に添加すべき挿入断片の量は［40 ng担体×0.5 kb挿入断片÷2.974 kb担体］×3／1＝20.2 ngである。
ゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキットT 4の原理