pBLUE−TベクタークローニングキットT 4の原理ベクターその他

pBLUE-Tベクタークローニングキット

pBLUE−TベクタークローニングキットT 4の原理ベクターその他

ディレクトリ番号：42014

キット組成、保管、安定性：

−20℃で保存し、6ヶ月以内に使用効果に影響しない。

製品紹介：

Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼなどの高温DNAポリメラーゼ増幅PCR生成物の多くは3’-末端後にはいずれも突出した塩基Aがあり、このようなPCR生成物は3’-pBLUE−TベクターはpBlueScriptII SK（+）プラスミドに由来し、EcoRI酵素カット部位に適切な配列を添加し、XCM I酵素カットを経てその3’末端が直接未対のT塩基を産生してなるため、より高い組換え効率がある。pBLUE−Tベクター挿入部位の両端du特設計の2つのECOR I部位により、挿入フラグメントを安価で効率的なECOR Iモノ酵素で切断して検出することができる、同時にpBLUE−TベクターはNdeIまたはNcoI制限エンド酵素部位を含まず、上述の酵素切開部位を含む遺伝子のクローニングに便利である。また、当社のキャリア接続システムには背景が低く（青斑は10%未満）、再結合率が高い（白斑の90%以上は挿入断片がある）、迅速に接続できるなどの特徴がある。本明細書の最後にはpBLUE−Tベクターに関する技術資料が記載されており、その全配列はpBlueScriptII SK（+）配列を参照することができるが、そのポリクローナル酵素の切断部位で配列が少し異なるだけである。

配列決定にはT 3、T 7プロモータープライマーとM 13汎用配列決定プライマーを用いることができる（後のスペクトルを参照）

操作手順：

1. 接続反応の準備：

PCR生成物を精製するかどうかは、増幅生成物の品質に依存する。PCR生成物が非常に清潔であれば、精製せずに結合反応を行うことができる。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動により分離することができる。当社製DNA産物の迅速精製回収キット対70 bp以上のDNA断片をうまく回収することができる。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNAポリメラーゼを増幅したPCR生成物は、その末端に突出した3’を持っている-A.。 3’-A末端のPCR生成物は、直接pBLUE−Tベクターを用いてクローン結合することができる。3’を有する®-端加A作業。

2. 一般的な接続反応：

1）標準的な10米l連結反応系に1を加える米l3pblue-tの0%キャリア、X米l PCR生成物（通常の状況では、ポリメラーゼ連鎖反応生成物は正確な定量を行い、一般的にPCR生成物と担体のモル比を2：1 ~ 10：1に最適化すると良好な結果が得られ、3：1を推薦する）、1米l 10´接続緩衝液および0.5-1米l(2.5-5 Weiss Units）のT 4 DNALigase，残りは水で補う。反応は以下のシステムで行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2）16℃で一晩接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

一般に16℃で一晩接続することを推奨する（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系標準リガーゼ量は2.5Weiss単位すなわち)、最も多くの形質転換子を得ることができる。しかし、本システムにはPEG Enhancerが含まれており、接続効率を数倍に高めることができます，高リガーゼ量の場合（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系推奨リガーゼ量5Weiss単位）16℃で30分間接続すれば、一般的な研究の要求に達することができる。

3)氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。

3.

1）反応は以下の系で行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2）22℃で5〜10分間接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

2 ´Quick Ligation Bufferには最適化された高速接続成分がすべて含まれており、通常は22℃で10分間接続することを推奨しています。（英語）。（英語）：Quick Ligation Buffer（英語）：（英語）：（英語）（英語：Ku（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系リガーゼ量5Weiss Unitsまた本システムは16℃で30分間接続することもできる（10米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）系リガーゼ量5Weiss Units）は一般的な研究の要求に達することができる。

3)

4. 変換:

ð50-100米l感受性細胞を氷の上に置き、wanを全解凍した後、軽く何回かはたいて細胞を均一に懸濁させた。

に4-5を追加米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）結合液（感受性細胞の体積の1/10以下の体積であれば、すべて添加することができます）は、軽く混合します。氷の上に置く30分です。42℃水浴熱刺激90秒です。氷の上に2を置く~ 3分です。

にプラス500米LBまたはSOC培地（抗生物質を含まない）、37℃150 rpm発振培養60分。

に将200米アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）細菌を事前に16米l 50mg/ml IPTGおよび40米l 20 mg/ml X−galコーティングアンモニアベンジル青カビス平板上。

塗布細菌の使用量は結合の効率及び受容体細胞の受容率に応じて適切に調整し、もし予想されるクローンが少ない場合、遠心分離（4000 rpm、2分）後に培養液の一部を吸引除去し、適量の培地懸濁菌体を残した後、すべて又は適量を1つの平板に塗布することができる（塗布した残りの菌液は4度に保存し、2日目に転化菌数が少ない場合、残りの菌液をすべて新しい培養板に塗布することができる）。

にプレートを37℃で1時間順方向に放置して過剰な液体を吸収し、その後一晩逆さまに培養した。
5フィルタ：

1).アダプタの青白フィルタ：

中後、外因性のためDNAの核酸配列の存在はLacZ遺伝子のコードを変え、その生成物に影響を与えるb半乳糖苷酶一フラグメントが活性であるため、組換えクローンはX-gal/IPTG平板上で青色ではなく白色に見える。時にはクリップの挿入に影響はありませんlacZ遺伝子はコードボックスを読んだり、挿入断片が小さすぎたりして、この場合コロニー（組換えクローン）は水色を呈したり、コロニー中心に淡青斑点を呈し、外周は白色（魚眼状青斑fish eye）である。IPTG/X-galプレート上に成長させた白色コロニーまたは水色コロニーを選択し、楊枝を用いてアンピシリルペニシス含有液体培地に挑み、37℃で一晩培養した。
2).

a上記培養した白色コロニーの菌液を用いてプラスミドを抽出し、ECORIモノ酵素を用いて切断するか、または他の適切な酵素を用いて切断し、アガロースゲル電気泳動により断片の大きさを検査し、目的の断片を含有するかどうかを確定した。

b白色コロニーを採取して直接PCR検査を行う（分子クローンの第3版を参照するか、お問い合わせください）

c.目的のクローンが含まれるかどうかを決定するために、T 3およびT 7プロモータープライマーまたは他の適切なプライマー配列決定を使用する。

結合反応に必要なPCR生成物の量をどのように計算しますか。

［添加担体の量（ng）×挿入断片の大きさ（kb）÷担体の大きさ（kb）］×挿入断片と担体のモル比＝挿入断片の量（ng）：例えば、挿入断片と担体の結合のモル比は3：1であり、例えば、結合反応に担体40 ngを添加し、挿入断片の大きさは1000 bpであり、この時に添加すべき挿入断片の量は［40 ng担体×1 kb挿入断片÷2.984 kb担体］×3／1＝40.2 ngである。

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