ゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキットT 4の原理

ゼロ鈍感簡単迅速結紮キット
pZERO鈍感単純ゼロバックグラウンドフラットエンド高速接続キット
(MCSを含まない）

ゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキットT 4の原理

キット組成、保管、安定性：

−20℃で保存し、6ヶ月以内に使用効果に影響しない。

製品紹介：

ゼロバックグラウンド平末端高速接続キットは優れたzi殺遺伝子陽性選択クローンシステムであり、平末端PCR生成物と平末端を有する任意のDNA断片を効率的にクローンすることができる。このキットはリン酸化または非リン酸化DNA断片のいずれにも有効である。陽性選択ベクターと挿入フラグメント接続はわずか5分で90%を超える陽性組換えクローンを得ることができる。修正活性を有するポリメラーゼ（例えば：Pfu polymerase）によって増幅された平末端PCR生成物は、クローンベクターに直接結合することができる。連結生成物は、一般的に使用される大腸菌株を直接変換することができる。

キットは、新規なzi殺遺伝子陽性選択クローンベクターpZERO−Blunt Simpleを提供する。このベクターには致死的なzi殺し遺伝子が含まれており、ベクターと断片の接続に成功した場合、zi殺し遺伝子は正確に発現できず、組換え子を含む細胞は正常に成長することができる。この陽性スクリーニング戦略は青白斑スクリーニングを必要とせず、クローンスクリーニングプロセスを大幅に加速させた。

pZERO-Blunt Simpleは挿入部位付近のポリクローナル酵素カット部位を除去し、PCR増幅プライマーに適切な酵素カット部位を導入する必要がある。この時、PCR増幅プライマーに導入された酵素カット部位を用いてDNA酵素カットを行うと、酵素カット反応はTベクター上の他のポリクローナル酵素カット部位上の制限酵素の影響を受けず、酵素カット効率を大幅に向上させ、アク隆起パワーを増加させることができる。

操作手順：

1. 接続反応の準備：

平末端PCR生成物または酵素カット後の平末端断片はアガロースゲル電気泳動により分離回収することができる（長波紫外光下カットまたは可視光透過カットを用いてDNA損傷による接続失敗を回避する）。担体に対するモル比は3：1である。当社製DNA産物迅速精製回収キットは、70 bp以上のDNA断片を良好に回収することができる。

2.

1) 標準的な10米l連結反応系に1を加える米L 40，<NUM>pzero不動態単純Chの＃1米l PCR生成物（通常の状況では、PCR生成物を正確に定量する必要はなく、一般的なPCR生成物と担体のモル比を1：1 ~ 10：1に最適化すれば良好な結果が得られ、3：1を推薦し、付録を参照）、5米l 2´Quick ligation Bufferと0.9米

反応は以下のシステムで行った：

一般的に最後にT 4 DNA Ligaseを加える。

2) 22℃で5〜10分間接続する（一般的にはPCR装置で行うことができる）。

通常、22℃で5〜10分間接続することが推奨され、>3 kbの長い断片接続は30分間に延長することができる。30分を超えることは推奨されず、超えると形質転換子の数が減少する可能性がある。

3) 氷の上で冷却し、次いで−20℃に転化または保存した。

3. 変換:

1) 100米l感受性細胞を氷の上に置き、wanを全解凍した後、軽く何回かはたいて細胞を均一に懸濁させた。

2) 4-5を追加米l結合液（結合液の体積が感受性細胞の体積の1/10を超えない限り、すべて添加することができる）、軽く混合する。氷の上に30分置く。

3) 42℃の水浴で90秒間熱刺激した。氷の上に2 ~ 3分置く。

4) プラス500米LBまたはSOC培地（抗生物質を含まない）、37℃150 rpm振動培養60分間。

5) 200米lアンモニアベンジル青カビス（100米g/ml）平板上。

塗布細菌の使用量は結合の効率及び受容体細胞の受容率に応じて適切に調整し、もし予想されるクローンが少ない場合、遠心分離（4000 rpm、2分）後に培養液の一部を吸引除去し、適量の培地懸濁菌体を残した後、すべて又は適量を1つの平板に塗布することができる（塗布した残りの菌液は4度に保存し、2日目に転化菌数が少ない場合、残りの菌液をすべて新しい培養板に塗布することができる）。

6) プレートを37℃で1時間順方向に放置して過剰な液体を吸収し、その後一晩逆さまに培養した。

4. フィルタ:

5. 通常検査：得られたコロニーをLB 1-5 ml（最終濃度100を含む米g/mlのアンピシリルペニシス）培地、37℃揺床振動培養一晩、菌種保存後プラスミドを抽出し、PCRまたは酵素切断方法を用いて挿入フラグメントが正しいかどうかを鑑定した。

6. 迅速検査：コロニーを採取して直接PCR検査を行う（分子クローニング第3版を参照するか、当社のCV 05-汎用T担体コロニーPCR鑑定キット明細書を参照することができる）。

7. シーケンシング同定：キット持参プライマーまたはT 7プロモータープライマーシーケンシングを使用して目的のクローンが含まれているかどうかを判断する。

本キットには配列決定プライマー（コロニーPCR同定プライマーにも使用）を持参する：

付録：

に 結合反応に必要なPCR生成物の量をどのように計算しますか。

［添加担体の量（ng）×挿入断片の大きさ（kb）÷担体の大きさ（kb）］×挿入断片と担体のモル比＝挿入断片の量（ng）例えば、挿入断片と担体の結合のモル比は3：1であり、例えば、結合反応に担体40 ngを添加し、挿入断片の大きさは500 bpであり、この時に添加すべき挿入断片の量は［40 ng担体×0.5 kb挿入断片÷2.974 kb担体］×3／1＝20.2 ngである。

ゼロバックグラウンド平末端クイッククローニングキットT 4の原理