One Step Seamless Cloning Kitシームレスクローニング

ワンステップシームレスクローンスイート（シングルクリップ)

One Step Seamless Cloning Kitシームレスクローニング

ディレクトリ番号：42111

包装量：

製品保管：-20°C保存、複数回の繰り返し凍結融解を避ける

製品の説明：ワンステップシームレスクローニングキットはT 4リガーゼに依存せず、ベクターと目的フラグメントの酵素切断部位に制限されず、直接重複フラグメント再結合の方法を用いて、特殊な酵素組み合わせを用いて任意の方法を線形化したベクターとその両端に16-25 bpの重複領域を有するPCRフラグメントを方位再結合結合結合することができ、30分以内にA末端または平末端PCR生成物フラグメントの高効率方位シームレスクローニングをベクターの任意の部位に実現することができる。

製品特徴：

1.

2.ベクターおよび挿入フラグメント酵素の切断部位の可用性および末端/粘性末端に制限されず、任意の部位でクローニングすることができる。

3. 挿入点に不要な塩基配列を導入することはありません。

4. リガーゼ及びホスファターゼに依存せず、高効率、正確、クローン陽性率は95%以上に達することができる。

ワンステップシームレスクローニングキットの原理概略図：

線形化ベクター及び挿入DNA断片の調製：

A.

(1).酵素切断源：酵素切断により得られた線形担体、平末端または粘端、単酵素切断または二酵素切断のいずれでもよく、酵素切断後にゲル回収する。

注：ワンステップ法によるシームレスクローニング反応系内の無双鎖DNA連結酵素は、ベクター自己連結反応を起こさない。したがって、モノ酵素カット方式で製造された線形化ベクターであっても末端脱リン酸処理を行う必要はない。組換え産物の形質転換後に出現した偽陽性クローン（挿入フラグメントなし）は、酵素切不wa全非線形化環状ベクターの形質転換によって形成された。酵素カット後のゲル回収は、このような非線形化ベクターの割合をzuiの低さに下げることができることをお勧めします。

(2).逆PCR源：高忠実DNAポリメラーゼを用いて製造することを提案し、もし増幅ストリップが単一であればPCR生成物精製（貨物番号：DC 012-50）によって担体を得ることができ、そうでなければゴム回収（貨物番号：DC 011-50）によって担体を得ることができる。

注：逆PCRのプラスミドテンプレートも非線形化ベクターであり、偽陽性クローン（挿入フラグメントなし）を引き起こす可能性もあるため、PCR源線形ベクター（PCR産物）の精製前にDpn Iエンド酵素を用いてプラスミドテンプレートを消化することで、背景を下げ、陽性率を高めることができる。しかし、一般的には、このような非線形化担体の割合をzuiより低くするのに十分なゲル回収が行われているため、逆PCR源の線形化担体もゲル回収を推奨している。

B：挿入DNA断片の調製

(1).ワンステップシームレスクローニングプライマー設計の総原則は、挿入フラグメント増幅産物5’及び3’の最端がそれぞれ線形クローニングベクターの両端に対応するwanと完全に一致する配列（16 bp〜20 bp）を有するように、プライマー5’端に線形クローニングベクターの末端相同性配列を導入することによって行う。

(2).

クローニング順方向プライマー（5’−3’）：線形ベクター順方向16−25 nt重なり領域配列（3’末端から）＋挿入フラグメント順方向特異プライマー配列（18−25 nt）

クローン逆プライマー（5’−3’）：線形ベクター逆16−25 nt重なり領域配列（3’末端から）＋挿入フラグメント逆特異プライマー配列（18−25 nt）

注意：オーバーラップ領域の塩基数は少なくとも16 bpであり、多段オーバーラップ領域間のTm値は一致していなければならず、＞60°C（AT pair＝2°C and GC pair＝4°C）でなければ、要求に合致するまで塩基数を延長することができる。

線形担体末端の構造（5’突出、3’突出、平末端）に従って、プライマー設計も3種類の状況に分けて、以下のように模式する：

線形化担体の両端は線形方式（例えばモノ酵素切断、ビス酵素切断、逆PCR）によって異なり、以上の3種類の末端構造の2、2の任意の組み合わせであり、挿入断片特異性プライマー設計の原則は一般プライマー設計の原則に従えばよい。

増幅プライマーのアニーリング温度を計算する場合、遺伝子特異的増幅配列のTm値を計算するだけで、ベクター末端相同配列は計算に参加すべきではない。

(3).酵素の選択：高忠実DNAポリメラーゼまたはPCR Mix（貨物番号：P 517-05またはP 814-05）の使用を推奨する。

(4).反応条件：一般的には具体的に使用されるポリメラーゼの説明書に従って行えばよい。

(5).挿入クリップの精製

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） オプション：もし断片がプラスミドテンプレートに由来し、そのプラスミドが組換えベクターと同じ抵抗性を持っている場合、精製前にDpnIエンド酵素でプラスミドテンプレートを消化すると、背景を下げ、陽性率を高めることができる。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） フラグメントが単一の場合は、PCR生成物精製キット（商品番号：DC 012-100）を用いてフラグメントを精製することを推奨する。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） 非特異的な増幅がある場合は、接着剤回収キット（品番：DC 011-100）で断片を回収することをお勧めします。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） この方法を用いてクローンを作成し、ベクターを線形化するために用いられる酵素切開部位はスプライシングの際に欠落することがあり、もし酵素切開部位に厳しい要求がある場合は、酵素切開部位の選択に注意することを提案し、必要な場合は正逆クローンプライマーの重複領域配列と特異遺伝子配列の間失われた塩基を増加させて元の酵素切断部位を回復する（後述）。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット） 組換えプラスミドがタンパク質発現に使用される場合、プライマー設計時にコードボックス、タンパク質発現及び精製に必要な配列（プロモーター、RBS配列、開始コドン、終了コドン、タンパク質ラベルなど）は破壊されないことに注意する。

順方向プライマー設計例（EcoR I酵素切開）：

上図のように、担体はEcor I酵素によって切開され、5’突出末端を形成する：

上記の設計原則に基づいて、3’端から計算し、16 bp-25 bpを逆算し（本例では20 bp端重畳同一配列を採用した）、目的の断片特異プライマー配列の前に加えればよい。オーバーラップ領域のTm値が60°C（AT pair＝2°C and GC pair＝4°C）のままであることを確認します。

順方向プライマーは、具体的には、5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGnnnnnnnnnn 3’

EcoR I酵素カット部位を保持する必要がある場合は、ベクター末端20 bpオーバーラップ配列と目的フラグメント特異プライマー配列との間に欠損したEcoR I認識部位配列aattcを補完し、クローン結合を完了した後もEcoR I酵素カット部位は存在する（酵素カット部位を保持する）必要がある。

具体的には、5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNRNNNNNNNNN 3'

逆プライマー設計例説明（Hind III酵素切開）：

上図のように、担体はHind III酵素によって切開され、5’突出末端を形成する：

上記の設計原則に基づいて、3’端から計算し、16 bp-25 bpを逆算し（本例では20 bp端重畳同一配列を採用した）、目的の断片特異プライマー配列の前に加えればよい。オーバーラップ領域のTm値が60°C（AT pair＝2°C and GC pair＝4°C）のままであることを確認します。

逆プライマーは、具体的には、5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAnnnnnnnnnn 3’

注意：上記プライマーの設計によりクローン結合が完了すると、Hind III切開点が消失する（酵素切開部位を保持しない）。

Hind III酵素カット部位を保持する必要がある場合は、キャリア末端20 bpオーバーラップ配列と目的断片特異プライマー配列との間に欠損したHind III識別部位配列agcttを補完する必要があり、Hind III酵素カット部位は依然として存在する（酵素カット部位を保持する）。

具体的には、5'CTGCCATCGGATCGTTCGCA3フィート

シームレスクローン反応の操作手順：

注意：2×OneStep Cloning Mixは接続強化剤PEGを含んで粘稠で、冷蔵庫から出した温度が低い時はもっと粘稠で、手のひらで凍らせて数分温度を高めることができて粘稠度を下げることができて（品質に影響しません）、軽く弾いて混ぜて、瞬間遠心分離して管の底まで収集します。

1. 以下の表に従って反応系を確立する（PCR管を用いて室温で調製可能）

*担体は一般的に20〜50 ngを用い、挿入断片と担体のモル比は2：1〜3：1の間が最適である、挿入フラグメントが200 bp未満の場合、挿入フラグメントと担体のモル比は5：1である。

2. 軽く混ぜて、50°C反応は15分間（PCR機器上で行うことができる）、反応終了後、PCR管を氷上に置いた後、直接−20に転化または保存する°C。短い断片、例えば100 bp-1 kbは15分だけで十分な形質転換子を得ることができ、長い断片の接続は、反応時間を60分まで延長することができる。

3. 反応生成物5μlを受容細胞の説明書に従って形質転換する（形質転換子が少ない場合、すべての生成物を形質転換し、すべての形質転換液を塗布することができる）。

陽性クローンの同定：

具体的な状況に応じて、コロニーPCR同定を選択し、プラスミド（貨物番号31013-100）を抽出して制限的なインターロイナーゼ同定または配列決定同定を行うことができる。

One Step Seamless Cloning Kitシームレスクローニング