One Step Gibson Cloning Kitシームレスクローニング

ワンステップGibsonクローンキット

（1～5個のフラグメントを接続可能）

One Step Gibson Cloning Kitシームレスクローニング

ディレクトリ番号：42112

パッケージ量：

製品保管：-20°C繰り返し凍結融解しないように保存する

製品摘要：本製品は依存しないテトラヨードメチルアデノゲンリガーゼは、ベクターと目的フラグメントの酵素切断部位に制限されることなく、重複フラグメントを直接再結合する方法であり、特殊な酵素組み合わせを用いて任意の方法を線形化したベクターとその両端に15-25bpオーバーラップ領域のポリメラーゼ連鎖反応フラグメント（フラットエンド）の方向性再編成により、迅速に実装可能1-5個のフラグメントの効率的なシームレスクローン。

製品特徴：

1. 30分は1つ以上を長く、短くすることができますポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメント（平坦端）はキャリアに挿入される。

2. 非担体および挿入フラグメント酵素の切断部位の有用性と担体平端/粘性末端の制限は、任意の部位でクローンを作成することができます。

3.挿入点に不要な塩基配列を導入することはありません。

4.効率的、正確、陽性率＞95%。

線形化ベクター及び挿入DNA断片の調製：

A：線形化担体の製造方法について：（1）：線形化担体の製造方法について。（1）：（1）：（1）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（2）（3）（3））（2）（3）（3）

(1).酵素切断源：酵素切断により得られた線形担体は、平末端または粘端、単酵素切断または二酵素切断のいずれでもよく、酵素切断後にゲル回収する。

注：継ぎ目のない接合とクローン反応系内の無双鎖DNA連結酵素は、ベクター自己連結反応を発生しない。したがって、モノ酵素カット方式で製造された線形化ベクターであっても末端脱リン酸処理を行う必要はない。組換え産物の形質転換後に出現した偽陽性クローン（挿入フラグメントなし）は、酵素切不wanの完全に線形化されていない環状ベクターの形質転換によって形成された。酵素カット後のゲル回収は、このような非線形化ベクターの割合をzuiの低さに下げることができることをお勧めします。

(2).逆PCR源：

注：逆PCRのプラスミドテンプレートも非線形化ベクターであり、偽陽性クローン（挿入フラグメントなし）を引き起こす可能性もあるため、PCR源線形ベクター（PCR産物）の精製前にDpn Iエンド酵素を用いてプラスミドテンプレートを消化することで、背景を下げ、陽性率を高めることができる。しかし、一般的には、このような非線形化担体の割合をzuiより低くするのに十分なゲル回収が行われているため、逆PCR源の線形化担体もゲル回収を推奨している。

B：挿入DNA断片の調製

(1).単一挿入フラグメントクローンプライマー設計：クローンプライマーには、挿入フラグメント特異的プライマー配列とオーバーラップ配列が含まれる。

クローニング順方向プライマー（5’−3’）：線形ベクター順方向16−25 nt重なり領域配列（3’末端から）＋挿入フラグメント順方向特異プライマー配列（18−25 nt）

クローン逆プライマー（5’−3’）：線形ベクター逆16−25 nt重なり領域配列（3’末端から）＋挿入フラグメント逆特異プライマー配列（18−25 nt）

注意：重畳領域の塩基数は少なくとも16 bpであり、多段重畳領域間のTm値は一致していなければならず、＞60°C（AT pair＝2°C and GC pair＝4°C）でなければ、要求に合致するまで塩基数を延長することができる。

線形担体の末端の構造（5’突出、3’突出、平末端）に従って、プライマー設計も3種類の場合に分けられる。

線形化担体の両端は線形方式（例えばモノ酵素切断、ビス酵素切断、逆PCR）によって異なり、以上の3種類の末端構造の2、2の任意の組み合わせであり、挿入断片特異性プライマー設計の原則は一般プライマー設計の原則に従えばよい。

増幅プライマーのアニーリング温度を計算する場合、遺伝子特異的増幅配列のTm値を計算するだけで、ベクター末端相同配列は計算に参加すべきではない。

上記の設計原則に基づいて、3’端から計算し、16 bp-25 bpを逆算し（本例では20 bp端重畳同一配列を採用した）、目的の断片特異プライマー配列の前に加えればよい。オーバーラップ領域のTm値が60°C（AT pair＝2°C and GC pair＝4°C）のままであることを確認します。

順方向プライマーは、具体的には、5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGnnnnnnnnnn 3’

注意：上記プライマーの設計によりクローン結合が完了すると、EcoR I酵素カットポイントは消失する（酵素カットポイントを保持しない）。

保存が必要な場合 EcoR I酵素カット部位は、担体末端20 bp重なり配列と目的断片特異プライマー配列との間に欠損したEcoR I識別部位配列aattcを補完する必要があり、クローン結合が完了した後も、EcoR I酵素カット部位は存在した（酵素カット部位を保持）。

具体的には、5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNRNNNNNNNNN 3'

担体はHind III酵素によって切開され、5’突出末端を形成する：

上記の設計原則に基づいて、3’端から計算し、16 bp-25 bpを逆算し（本例では20 bp端重畳同一配列を採用した）、目的の断片特異プライマー配列の前に加えればよい。オーバーラップ領域のTm値が60°C（AT pair＝2°C and GC pair＝4°C）のままであることを確認します。

逆プライマーは、具体的には、5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAnnnnnnnnnn 3’

注意：上記プライマーの設計によりクローン結合が完了すると、Hind III切開点が消失する（酵素切開部位を保持しない）。

保存が必要な場合 Hind III酵素カット部位は、キャリア末端20 bpオーバーラップ配列と目的フラグメント特異プライマー配列との間に欠損したHind III識別部位配列agcttを補完する必要がある ，Hind III酵素カット部位は依然として存在する（酵素カット部位を保持する）。

具体的には、5'CTGCCATCGGATCGTTCGCA 3フィート

(2).複数の挿入フラグメントのクローンプライマー設計：キャリアの両端に接続する挿入フラグメントプライマー設計方法と単一フラグメント設計方法

*複数の挿入フラグメント間のオーバーラップ領域には、上述の*マーク（青と赤）の2つの方式が設計されており、マルチフラグメントプライマー設計時に、フラグメントとフラグメントの間に15〜25 bpのオーバーラップ領域があることを保証するために、任意の1つの方式または2つの方式を選択して混合することができる。

(3).酵素の選択：高忠実DNAポリメラーゼまたはPCR Mix（貨物番号：P 517-05またはP 814-05）の使用を推奨する。

(4).反応条件：一般的には具体的に使用されるポリメラーゼの説明書に従って行えばよい。

(5).

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）オプション：フラグメントがプラスミドテンプレートに由来し、このプラスミドが組換えベクターと同じ抵抗性を有している場合、精製前にDpnIエンド酵素を用いてプラスミドテンプレートを消化すると、背景を低下させ、陽性率を高めることができる。

アルファベットl（英語アルファベットの12番目のアルファベット）フラグメントが単一である場合は、PCR生成物精製キット（商品番号：43012−100）を用いてフラグメントを精製することを推奨する。

l非特異的な増幅がある場合は、接着剤回収キット（商品番号：43011-100）で断片を回収することをお勧めします。

lこの方法を用いてクローンを作成し、ベクターを線形化するために用いられる酵素カット部位は、スプライシングの際に欠落することがあり、酵素カット部位に厳しい場合は、 酵素カット部位の選択に注意し、必要に応じて失われた塩基を増加させて元の酵素カット部位を回復する（前述の正逆プライマー設計例を参照）。

l組換えプラスミドがタンパク質発現に使用される場合、プライマー設計時にコードボックス、タンパク質発現及び精製に必要な配列（プロモーター、RBS配列、開始コドン、終了コドン、タンパク質ラベルなど）は破壊されないことに注意する。

シームレスクローン反応の操作手順：

注意：2×Cloning Master Mixは接続増強剤PEGを含んで粘稠で、冷蔵庫から出した温度が低い時はもっと粘稠で、手のひらで凍らせて数分温度を高めることができて粘稠度を下げることができて（品質に影響しません）、指bo打遠心管の底は十分に混和しているか、渦振動が混和している。

1. 以下の表に従って反応系を確立する（PCR管を用いて室温で調製可能）

*担体は一般的に10−50 ngを用い、挿入断片と担体のモル比は2：1−3：1の間が最適である、挿入フラグメントが200 bp未満である場合、挿入フラグメントと担体のモル比は5：1、多フラグメントで接続されている場合、フラグメントとフラグメントのモル比は1：1である。

2. 軽く混ぜて、50°°C。3つの断片を超える結合は、反応時間を30分まで延長することができる。

3. 反応生成物5μlを受容細胞の説明書に従って形質転換する（形質転換子が少ない場合、すべての生成物を形質転換し、すべての形質転換液を塗布することができる）。

陽性クローンの同定：

具体的な状況に応じて、コロニーPCR同定を選択し、プラスミド（貨物番号31011-100）を抽出して制限的なインターロイナーゼ同定または配列決定同定を行うことができる。

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