局所組織構造蛍光染料HistoBright

局所組織構造の可視化を可能にする蛍光染料

歴史が明るい.

HistoBrightは二光子励起を実現できる環境応答型膜染色蛍光色素であり、組織透過性に優れ、組織の局所構造に応じて蛍光特性を変えることができるので、高コントラストの組織可視化を実現することができる。組織透明化処理と二光子レーザー顕微鏡を組み合わせて使用することで、組織ブロックの深さ観察と空間構造解析を行うことができる。

※本製品は高知大学と愛媛大学の研究成果に基づいて、フナコーシ（株）が生産し、販売している。

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HistoBrightは、溶媒の極性に応じて広範囲の波長を示す環境応答型蛍光色素である。透明化処理後の組織に適用すると、組織内の微小環境に応じて蛍光が変化し、その後に二重光を配合するサブレーザ顕微鏡では組織構造を明確に観察することができる。

◆従来の組織構造解析方法と新規な3次元組織構造解析

伝統的な組織構造分析は、蘇木精−伊紅（HE）染色法などの着色染料による組織の染色によって実現されている。これらの着色染料を使用すると、組織ブロック全体を染色するのは難しく、一般的には薄いスライスを作成してから観察する必要があります。しかし、薄いスライスは組織構造の3 D情報を失いやすいため、3 D構造を再現するためには大量のスライスを作成する必要があります。

HistoBrightは高知大学教育研究部の仁子陽輔博士が合成した新型環境応答型蛍光染料（原著論文中の化合物名はPC）で、現在は愛媛大学医学部の今村健志博士、村上正基博士、川上良介博士が3次元組織構造に応用した蛍光イメージング染料の開発を進めている。HistoBrightは生体膜に集まり、局所環境によって蛍光は~近赤外光の広い範囲で変化します。したがって、HistoBrightを生体組織に適用すると、組織構造に応じて蛍光色調の変化を誘導し、高コントラストで組織構造を観察することができる。HistoBrightは二光子励起ができるため、レーザー共焦点顕微鏡のほか、二光子レーザー顕微鏡を用いて観察することができる。また、組織透明化処理（膜構造を保持して脱脂操作を行う方法を除く）に合わせて、HistoBrightを使用して組織構造を破壊しない（薄いスライスを製造しない）前提で厚い組織サンプルを観察し、二光子レーザー顕微鏡による深結像を行い、組織の三次元構造分析を実現することができる。

◆特徴

●周囲環境に応じて表現できる環境応答型の膜染色試薬グリーンライト~近赤外光の蛍光特性を有している。検出すべき蛍光波長範囲を区別することにより、高コントラストの局所組織接合を実現することができる

●脱脂処理のない組織透明化処理（RapiClear（SunJin Lab社）、LUCIDなど）を配合し、深さのある組織構造の3次元分析を実現することができる。

●※界面活性剤（トリトンX-100、Tween 20など）を使用すると組織中の脂質膜が溶解し、HistoBrightの染色に影響を与える可能性があるため、使用を推奨しない。使用する場合は、適用条件を検討してください。

●レーザー共焦点顕微鏡（推奨励起光：488 nmレーザー）または二光子レーザー顕微鏡（推奨励起光：960 nmレーザー）を用いて観察することができる。

●二光子レーザー顕微鏡を用いて観察する場合、第二高調波発生（SHG）イメージングを併用し、本剤を用いながら未染色組織中のコラーゲン繊維を観察することができる。

●HistoBrightを用いて染色と観察を行った後、HE染色を行うことができる。

◆原著原文

J.Materら。化学。B10(10), 1641～1649 (2022).新型プッシュプルピレン染料の合成、光物理特性及び人体細胞と皮膚組織イメージングにおける応用。[PMID:35194628]

◆原理

励起/発光スペクトル

HistoBrightは、溶媒の分子極性に応じて蛍光特性を変化させる溶媒極性応答型蛍光染料（Solvatochromic fluorescent dye）である。溶媒の極性に応じて、蛍光は緑（低極性）方向近赤外光（高極性）の範囲内で大きく変動する。

リポソーム膜モデルにおける蛍光スペクトルの変化

HistoBrightは脂質膜に対して高い親和性を示し、脂質膜の相状態に応じて異なる蛍光特性を示した。規則相Loモデル（鞘リン脂質（SM）／胆−固−アルコール（Chol））リポソームにおける蛍光最大値と異なり、無秩序相Ldモデル（DOPC）リポソームにおける最大波長も約30 nmの長波長範囲に移行し、蛍光量子収率も0.72（SM／Chol）から0.37（DOPC）に低下した。

※以上の蛍光スペクトルデータはすべて高知大学仁子陽輔博士より提供された。

◆応用データ

4%paraformaldehyde/PBSを用いてヒト正常皮膚組織塊を固定した後、76 hの組織透明化処理（LUCID）とHistoBright（10μM）染色と同時に500μmのスライスを作製した。二光子レーザー顕微鏡により、960 nmで組織塊をレーザー励起し、それぞれ492 nm（SHG：青（あお））500～550ナノメートル（緑)560~593nm(オレンジ）と593〜690 nm（赤

※492ナノメートル（青（あお））HistoBright源の蛍光信号ではなく、組織中のコラーゲン繊維からのSHG信号。

次に、二光子レーザー顕微鏡を用いてZ軸方向に5μm間隔で500μmの画像を連続的に撮影し、画像解析ソフトウェアを用いて三次元構築を行い、三次元的にヒト皮膚組織の微細構造を可視化した。

4%paraformaldehyde/PBSを用いてヒト正常皮膚組織塊を固定した後、1 mmのスライスに調製し、同時に72 hの組織透明化処理（RapiClear、SunJin Lab社）＊、HistoBright（10μM）染色と核染色（Hoechst 33342）を行った。2光子レーザー顕微鏡により、1100 nmのレーザーで組織塊を励起し、それぞれ＜492 nm（SHG：青（あお））500～550ナノメートル（緑）560 ~ 593ナノメートル（オレンジ）と593〜690 nm（赤）で蛍光画像をそれぞれ取得し、以下の4枚の合成画像を作成した。以上の条件に基づいて、Z軸方向に5μm間隔で連続撮影し、画像解析ソフトウェアを用いて3次元構築を行い、連続したデータをアニメーション化した。

＊本実験における組織塊固定後の透膜処理は行わず、直接透明化処理と染色を行った。

完全なビデオを確認してください：labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1466.html

HE染色の繰り返し使用

HistoBrightを用いて染色し、ヒト正常皮膚細胞組織塊を観察し、PBS中に静置し、透明化試薬を除去した。次に薄いスライスを作製し、HE染色を行った。HistoBright染色を確認した後も、明確なHE染色が可能である。

レーザ共焦点顕微鏡と二光子レーザ顕微鏡の下で染色を観察する

4%paraformaldehyde/PBSを用いてヒト正常皮膚組織塊を固定した後、0.5 mmのスライスを調製し、同時に72 hの組織透明化処理（RapiClear、SunJin Lab社）＊とHistoBright（10μM）染色を行った。その後、レーザー共焦点顕微鏡（左図：励起光488 nmレーザー）と二光子レーザー顕微鏡（右図：励起光960 nmレーザー）を用いて観察した。2枚の画像には明らかな違いはないが、2光子レーザ顕微鏡下では2光子励起のSHG信号（コラーゲン繊維）を観察することができる。

※以上の画像データは愛媛大学の川上良介博士が提供しています。

◆製品リスト