Fluo-8 AM無洗浄細胞カルシウム流検出キット

Fluo-8 AM無洗浄細胞カルシウム流検出キット成分と規格は以下の通りである。Fluo-8細胞搭載試薬の使用量は96-ウェルプレート1ウェル当たり100μL、384-ウェルプレート1ウェル当たり25μLであることが推奨されている。96 T、960 T及び9600 Tはそれぞれ1、10及び100枚の96−孔又は384−孔板の実験を行うことができる。

1、実験の必要に応じて96-ウェルまたは384-ウェル底部に細胞を接種し、細胞培地血清濃度は10%を超えない。実験による37℃5%CO2孵化箱で一定時間培養する。
2、Fluo-8搭載緩衝液とQF（10 x）試薬を取り出し、室温まで平衡にし、十分に混合する。
3、Fluo-8 AMを取り出し、室温で溶解し、遠心分離して内容物を管底に集め、氷の上に置く。Fluo-8 AMが一度に使い切られていない場合は、分割し、-20℃で光を避けて保存し、繰り返しの凍結融解を回避しなければならない。
4、1ウェル当たりの添加及びウェル内培地の等体積のFluo-8細胞搭載試薬による必要なFluo-8細胞搭載試薬の使用量の計算方法：（1）：Fluo-8細胞搭載試薬の使用量：（1）：（1）：（1）：（1）（1）（1）
5、Fluo-8細胞搭載試薬の調製：10 x QF試薬を10倍希釈でFluo-8搭載緩衝液に添加し、例えば1 mL 10 x QF試薬を9 mL Fluo-8搭載緩衝液に添加し、十分に混合する。Fluo−8 AMは400 Xであり、上述したように調製されたFluo−8装填緩衝液（1 xQFを含む）に1 Xずつ添加し、これはFluo−8細胞装填試薬である。
6、CHO細胞などの特定の細胞は、細胞が細胞内に入るFluo−8を細胞から輸送するのを抑制するために、Fluo−8細胞搭載試薬にプロbenecid（CAS：57−66−9）を添加する必要がある。プロピルスルホンshuは顧客自身が提供し、Fluo-8細胞搭載試薬のプロピルスルホンshu最終濃度は2.5 mMであることを提案した。異なる細胞に対して、最適濃度は最適化する必要があるかもしれない。
プロピルスルホンshu配合：1 N NaOHを用いて500 mM原液として調製し、使用前にまず1 X HBSS緩衝液で250 mMに希釈した後、Fluo-8細胞搭載試薬に加え、最終濃度は2.5 mM.（HBSS緩衝液は顧客自身が提供し、調合方法は20 mM HEPES buffer pH 7.4+1 X Hank's Balanced Salt Solution、pH 7.4）であった。
7、標準方法の検査：細胞培養プレートの孔内培地などの体積のFluo-8細胞搭載試薬、例えば96-孔プレートの孔当たり100μL培地に100μL Fluo-8細胞搭載試薬を添加する。
（オプションの検出方法：10%FBSを含む培地は読み取り値を低下させ、背景を増加させる可能性があり、孔内培地を除去し、Fluo-8細胞搭載試薬（ステップ5と6で調製）とHBSS緩衝液を1：1で混合し、2倍の体積原培地に相当するこの混合液を加えて検出することができる。
特定のインキュベーション温度（例えば、室温又は37℃）及び時間（0.5 hr−2 hr以上）は、特定の実験に従って最適化される必要がある。
9、細胞内カルシウム流の検査を行う：実験必要と検査設備に基づいて検査パラメータの設定を行い、試験化合物を添加し、底部示度で蛍光強度を検査する。適用可能な検出デバイスには、FlexStation、FLIPR（Molecular Devices）などがあります。ここで、FlexStation 3は、Ex／Em＝485／525 nmで蛍光を読み取る。

1、異なるロットは混用を推奨しない。
2、非経験証明書、検査試薬の使用量を変更することを提案しない。