高効率感受性細胞調製キット

高効率感受性細胞調製キット

ディレクトリ番号：30018

キット組成、保管、安定性：

短期的に4℃を使用し、汚染を避ける。長期保存-20℃で1年間有効。

製品紹介：

1. 高効率感受性細胞調製キット伝統的な高効率感受性細胞の調製方法に基づいて適切に改良したもので、操作が便利で、転化効率が高い。

2. 本キットを使用することで、受容状態効率を10にすることができます⁸cfu/μgプラスミド。小さいプラスミドでは効率がやや高いが、大きいプラスミドでは効率がやや低い。本キットを用いて調製した高効率感受性細胞はプラスミドを形質転換することができるだけでなく、通常の連結産物を形質転換することにも非常に適しており、特に平端連結を形質転換するなど高形質転換効率が必要な場合に適している。

3. 本キットを使用すると操作が簡単で、細菌が培養されてからわずか60分程度で高効率感受性細胞の調製が完了する。

4. 本キットは、Top 10、DH 5α、BL 21（DE 3）、JM 109、TG 1、HB 101、XL-1などを含む一般的な大腸菌のほとんどに適しています。しかし菌種によって転化効率は大きく異なる可能性がある。

5. 本キットは複数回に分けて使用することができ、100μlの受容体細胞を100本作製することができる。

v 注意事項：

1. すべての試薬、消耗品、機器、設備は必ず滅菌処理されている。

2. 受容体細胞を作製する過程では抗生物質を含まないLBが使用されている。受容体菌を使用する過程で熱ショック後の37℃で培養する際には、転入したプラスミドに耐性があっても抗生物質を含まないLBを使用しなければならない。

3. 受容体細胞の調製が完了したら、速やかに-70℃に移行してください。

操作手順：（実験前に注意事項を読んでください）

1. 平板を塗る：

優れた感受性状態効率を得るためには、グリセリン菌または他の形態で保存されている菌種をLBプレートに塗布し、一晩培養しなければならない。

2. 接種：

新鮮に培養した菌種のあるLBプレートを採取し、その後の操作はすべて超浄台内で行った。ピンセットの先端をアルコール70%につけ、アルコールランプに軽く焼き、ピンセットの先端を無菌状態にする。ピンセットで無菌のプラスチック銃頭または楊枝を挟み、平板からモノクローナルを1つ選び、次に菌種をつけたプラスチック銃頭または楊枝を3ミリリットルのSOBまたはLB（お客様は菌種に応じて適切な培地を選択すべき）が入った細菌培養試験管内に置く。上記操作は、接種リング等を用いて操作することもできる。

3. 培養：

37℃で約250 rpm一晩培養し、通常培養時間を16時間程度に制御することが望ましい。絶対に18時間を超えるべきではありません。

4. 再接種培養：

必要に応じて調製された高効率感受性細胞の量を、1：500の割合で新鮮培養一晩菌で接種培養した。例えば、新鮮な一晩菌100マイクロリットルを50ミリリットルのSOBまたはLBに採取し、37℃で約250 rpm培養した。

5. 感受性細胞の調製：

に 注意：遠心機の回転速度と遠心時間は感受性細胞の作製にとって非常に重要であり、異なる種類の細菌の優れた回転速度と遠心時間は異なり、具体的な状況に応じて最適化すべきである。優れた状況は適切な回転速度と遠心時間が細菌をちょうど遠心沈殿させ、あまり緊密にしてはならない。そうしないと重懸濁が困難で、強く吹いてこそ重懸濁ができ、細胞に損害を与え、転化効率に影響を与える。

1) 培養した細菌OD 600が0.5程度に達したら、培養した菌液を氷浴に入れ、15分間冷却する。注意：以降のすべての操作は4度または氷浴で行う必要があります。

2) 4℃（遠心機はあらかじめ冷却しておかなければならない）3000〜3500 gは5分間遠心分離して細菌を収集し、上清を廃棄する（できるだけきれいに上清を除去し、残存が少ないほど良い）。

3) 遠心沈殿前の菌量が50ミリリットルであれば、後続操作で行い、他の体積であれば比例換算して後続操作を行う。

4) 10ミリリットル予冷の高効率感受性状態を用いて溶液Aを軽く再懸濁した細菌沈殿物（再懸濁しやすいように、まず少量の溶液Aを加え、再懸濁した後に残りの溶液Aを加えることができる）を調製し、再懸濁を吹き付ける時は必ず柔らかくしなければならず、そうしないと効果に影響する。

5) 氷浴15分。

6) 4℃（遠心機は事前に冷却しなければならない）3000〜3500 gを5〜7分間遠心分離して細菌を収集し、清を廃棄した。

7) 溶液Bを2 mlの予冷した高効率感受性状態で軽く再懸濁した細菌沈殿物を調製した。吹き付けの重懸濁時は必ず柔らかくしなければならない。そうしないと効果に影響を与える。

8) 氷浴15分。

9) 氷浴上で分注を行い、必要に応じて50〜200マイクロリットル／管に適宜分注することができる。

10) 直ちに液体窒素またはエタノールドライアイス浴を用いて急速凍結した後−70℃で保存した。