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アドレス
上海市浦東新区
概要
Annexin V-APCアポトーシス検出キットは分子量35-36 kDのCa 2+依存性リン脂質結合タンパク質であり、アポトーシス中に膜外に反転するPSと高親和性特異的に結合することができる。PS外反転は細胞核の破裂、DNA断片化及びアポトーシス関連蛋白の出現前に発生し、これによりAnnexin VとPSの結合はアポトーシス早期のものとなった。.....
製品詳細
Annexin Vアポトーシス検査キットの紹介
保存温度：2-8℃遮光
Annexin Vアポトーシス検査キット注意事項
1.長期にわたって-20℃で保存する必要はありません。
2.Annexin V-APC染色液は繰り返し凍結融解を避ける。複数回の凍結融解は失効を招く。
3.Annexin V-APC染色液の長期保存が必要な場合は、使用状況に応じて少量分装した後-20℃で保存することができる。
2.Annexin V-APC染色液は繰り返し凍結融解を避ける。複数回の凍結融解は失効を招く。
3.Annexin V-APC染色液の長期保存が必要な場合は、使用状況に応じて少量分装した後-20℃で保存することができる。
有効期間
1年間
検出方法
1.フローサイトメータ
2.レーザー共焦点
3.蛍光顕微鏡
2.レーザー共焦点
3.蛍光顕微鏡
適用サンプル
1.懸濁細胞
2.壁貼り細胞
2.壁貼り細胞
製品の特徴
2.快速：1時間以内に実験を完成することができる、
3.正確：生細胞、アポトーシス細胞と壊死細胞を正確に区別し、各群の細胞の割合を計数することができる。
製品の用途
1.フローサイトメータ
2.レーザー共焦点
3.蛍光顕微鏡
2.レーザー共焦点
3.蛍光顕微鏡
計器の準備
1.フローサイトメータまたは蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点
2.遠心分離機。（2）遠心分離機。（2）遠心分離機。）（2）遠心分離機。）（2）遠心分離機。）（2）遠心分離機。（3））（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）
3.ピペット
4.冷蔵庫
5.アイスボックス
2.遠心分離機。（2）遠心分離機。（2）遠心分離機。）（2）遠心分離機。）（2）遠心分離機。）（2）遠心分離機。（3））（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）（3）
3.ピペット
4.冷蔵庫
5.アイスボックス
試薬準備
2.またはHBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
消耗品の準備
1.遠心管
2.吸込ヘッド
3.使い捨て手袋
4.アルミニウム箔
2.吸込ヘッド
3.使い捨て手袋
4.アルミニウム箔
Annexin Vアポトーシス検査キット使用上の考慮事項
1.螺旋蓋微量試薬管装の試薬は蓋を開ける前にしばらく遠心分離して、蓋内壁上の液体を管底に集めて、蓋を開ける時の液体損失による試薬量不足を避ける。
2.細胞処理は慎重に操作し、できるだけ人為的に細胞を損傷しないようにする必要がある。遠心力は細胞を失わない前提でできるだけ小さく、重懸濁細胞は動作が柔らかく、何度も激しい吹き付けを繰り返さないようにしなければならない。渦発振器は使用しない。
3.Annexin V-FITC（等）とPropidium iodide（等）は感光物質であり、操作時には光を避け、できるだけ光にさらされる時間を減らすように注意してください。必要に応じて蓋付きのアイスボックスやアルミホイルを使用して光を避けることができます。液体移動中の一時的な光線への曝露（30秒未満）は許容できる。
4.アポトーシスは迅速かつ動的なプロセスであるため、染色後すぐに分析を行う。
2.細胞処理は慎重に操作し、できるだけ人為的に細胞を損傷しないようにする必要がある。遠心力は細胞を失わない前提でできるだけ小さく、重懸濁細胞は動作が柔らかく、何度も激しい吹き付けを繰り返さないようにしなければならない。渦発振器は使用しない。
3.Annexin V-FITC（等）とPropidium iodide（等）は感光物質であり、操作時には光を避け、できるだけ光にさらされる時間を減らすように注意してください。必要に応じて蓋付きのアイスボックスやアルミホイルを使用して光を避けることができます。液体移動中の一時的な光線への曝露（30秒未満）は許容できる。
4.アポトーシスは迅速かつ動的なプロセスであるため、染色後すぐに分析を行う。
5.アポトーシスを検出するためには、Annexin V-FITC（等）キットを使用する必要があります。細胞を固定しないでください。固定操作は結果に干渉します。
使用方法
サンプル染色：
1.懸濁細胞を遠心的に収集する。遠心分離機300×g−500×g力、2−8°C、遠心時間5分間、培地を廃棄した。
2.細胞を冷PBSで2回洗浄した。
3.細胞を100μl 1 X Annexin V結合液で懸濁し、濃度は約1〜5 X 106 cells／mlであった。
4.細胞懸濁液に5μlのAnnexin V−APC染色液を加え、軽く混合した後、2−8°C遮光条件下で5−15分間インキュベートした。
5.PI（または7−AAD）染色液を添加した後、2−8°C遮光条件下で1〜3分間軽く混合してインキュベートした。（この手順は選択し、実験の必要に応じてAPC単染のみを行うこともできる）。
6.400μlのPBSまたは1 X Annexin V結合液を加え、軽く混ぜる。
7.直ちにフローサイトメータで測定した。
フローサイトメトリー解析：
処理された細胞は、この時点でフローサイトメータ上で分析することができる。
通常のフローアポトーシス検出の操作に従えばよい。
機械的検査の前に、測定すべき細胞を用いて品質制御サンプルを製造し、フローサイトメータの蛍光補償を設定し、十字ドアを設置する範囲：
（I）GFP等の標識をトランスフェクションしていない細胞
①ブランク管：陰性対照群細胞、染色していない細胞。Annexin V/APC、PIは加算されません。電圧調整に使用します。
②単染管：明らかにアポトーシスした細胞があり、Annexin V/APC染色のみを加えた。補償の調整に使用します。
③単染管：明らかにアポトーシスした細胞があり、PI染色のみを加えた。補償の調整に使用
④検査管：測定すべき処理細胞、Annexin V/APC、PIを加える。ブランク管と単陽管で電圧補償を調整した後、必要なフローデータを得る。
（II）GFP細胞のトランスフェクション
①未トランスフェクションブランク管：未トランスフェクション細胞、陰性対照群細胞、染色されていない細胞。Annexin V/APC、PIは加算されません。
②GFPブランクチューブのトランスフェクション：GFPをトランスフェクションした対照群細胞、染色した細胞はなかった。Annexin V/APC、PIは加算されません。補正の調整に使用
③トランスフェクションされていない単染色管：トランスフェクションされておらず、明らかにアポトーシスしている細胞は、Annexin V/APC染色のみを加えた。補償の調整に使用します。
④トランスフェクションされていない単染管：トランスフェクションされておらず、明らかにアポトーシスしている細胞には、PI染色のみを加えた。補償の調整に使用
⑤検査管：測定すべき処理細胞、Annexin V/APC、PIを加える。ブランク管と単陽管で電圧補償を調整した後、必要なフローデータを得る。
1.懸濁細胞を遠心的に収集する。遠心分離機300×g−500×g力、2−8°C、遠心時間5分間、培地を廃棄した。
2.細胞を冷PBSで2回洗浄した。
3.細胞を100μl 1 X Annexin V結合液で懸濁し、濃度は約1〜5 X 106 cells／mlであった。
4.細胞懸濁液に5μlのAnnexin V−APC染色液を加え、軽く混合した後、2−8°C遮光条件下で5−15分間インキュベートした。
5.PI（または7−AAD）染色液を添加した後、2−8°C遮光条件下で1〜3分間軽く混合してインキュベートした。（この手順は選択し、実験の必要に応じてAPC単染のみを行うこともできる）。
6.400μlのPBSまたは1 X Annexin V結合液を加え、軽く混ぜる。
7.直ちにフローサイトメータで測定した。
フローサイトメトリー解析：
処理された細胞は、この時点でフローサイトメータ上で分析することができる。
通常のフローアポトーシス検出の操作に従えばよい。
機械的検査の前に、測定すべき細胞を用いて品質制御サンプルを製造し、フローサイトメータの蛍光補償を設定し、十字ドアを設置する範囲：
（I）GFP等の標識をトランスフェクションしていない細胞
①ブランク管：陰性対照群細胞、染色していない細胞。Annexin V/APC、PIは加算されません。電圧調整に使用します。
②単染管：明らかにアポトーシスした細胞があり、Annexin V/APC染色のみを加えた。補償の調整に使用します。
③単染管：明らかにアポトーシスした細胞があり、PI染色のみを加えた。補償の調整に使用
④検査管：測定すべき処理細胞、Annexin V/APC、PIを加える。ブランク管と単陽管で電圧補償を調整した後、必要なフローデータを得る。
（II）GFP細胞のトランスフェクション
①未トランスフェクションブランク管：未トランスフェクション細胞、陰性対照群細胞、染色されていない細胞。Annexin V/APC、PIは加算されません。
②GFPブランクチューブのトランスフェクション：GFPをトランスフェクションした対照群細胞、染色した細胞はなかった。Annexin V/APC、PIは加算されません。補正の調整に使用
③トランスフェクションされていない単染色管：トランスフェクションされておらず、明らかにアポトーシスしている細胞は、Annexin V/APC染色のみを加えた。補償の調整に使用します。
④トランスフェクションされていない単染管：トランスフェクションされておらず、明らかにアポトーシスしている細胞には、PI染色のみを加えた。補償の調整に使用
⑤検査管：測定すべき処理細胞、Annexin V/APC、PIを加える。ブランク管と単陽管で電圧補償を調整した後、必要なフローデータを得る。
実験中、Annexin V染色は着色しなかったか、陽性率が低かった。考えられる理由は次のとおりです。
1.検出のためのフローサイトメータ／顕微鏡の設定が不適切である。正しい機器設定を調整して使用します。
2.実験中の誘導剤がアポトーシスを産生できるかどうかを決定する。このことは、正確なアポトーシス誘導効果を有する陽性薬物対照を設定することによって除外することができる。
3.細胞はアポトーシスを開始していない。誘導後アポトーシス開始の時点を再決定する（時間実験）。
4.細胞数が少ない。
5.壁貼り細胞の消化が適切ではない。Annexin VとPSの結合にはCa 2+イオンが必要で、結合液にはCa 2+が含まれており、EDTAの消化は染色に影響を与えるので、EDTAがないものを使用するか、消化後にPBSで洗浄することをお勧めします。
実験中は陽性率が高かった。考えられる理由は次のとおりです。
1.検出のためのフローサイトメータ／顕微鏡の設定が不適切である。正しい機器設定を調整して使用します。
2.細胞自体の活力が悪い。実験でアポトーシスを誘導していない対照細胞が染色された後、AnnexinV+/PI+双陽性の細胞割合が高すぎることが発見され、このような結果をもたらした原因は細胞自体の活力が悪すぎるためである可能性がある。台望藍染色を用いて細胞の活力を計算することを提案し、台望藍染色拒否細胞は95%より大きいべきである。活力が低い場合は、細胞を再回復することをお勧めします。通常、回復したばかりの細胞は少なくとも3回継代してから実験を行うことができます。
1.検出のためのフローサイトメータ／顕微鏡の設定が不適切である。正しい機器設定を調整して使用します。
2.実験中の誘導剤がアポトーシスを産生できるかどうかを決定する。このことは、正確なアポトーシス誘導効果を有する陽性薬物対照を設定することによって除外することができる。
3.細胞はアポトーシスを開始していない。誘導後アポトーシス開始の時点を再決定する（時間実験）。
4.細胞数が少ない。
5.壁貼り細胞の消化が適切ではない。Annexin VとPSの結合にはCa 2+イオンが必要で、結合液にはCa 2+が含まれており、EDTAの消化は染色に影響を与えるので、EDTAがないものを使用するか、消化後にPBSで洗浄することをお勧めします。
実験中は陽性率が高かった。考えられる理由は次のとおりです。
1.検出のためのフローサイトメータ／顕微鏡の設定が不適切である。正しい機器設定を調整して使用します。
2.細胞自体の活力が悪い。実験でアポトーシスを誘導していない対照細胞が染色された後、AnnexinV+/PI+双陽性の細胞割合が高すぎることが発見され、このような結果をもたらした原因は細胞自体の活力が悪すぎるためである可能性がある。台望藍染色を用いて細胞の活力を計算することを提案し、台望藍染色拒否細胞は95%より大きいべきである。活力が低い場合は、細胞を再回復することをお勧めします。通常、回復したばかりの細胞は少なくとも3回継代してから実験を行うことができます。
