品番：2013年4月5日

きおくじょうけん

プロダクトコンポーネント：

製品紹介

本キットはTUNEL法を用いて、終端デオキシリボヌクレオチド転移酵素（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT）を用いてアポトーシス細胞中でDNAを切断した3´-OH末端触媒をYFに組み込む®/Cy-dUTP，YF®/Cy−dUTP標識DNAは蛍光顕微鏡で直接観察するか、またはフローサイトメータで定量することができる。TUNEL法は、壊死細胞や照射や薬物治療によるDNA鎖断裂細胞ではなく、アポトーシス細胞を選択的に検出することができる。標識されたdUTP（例えば地gao辛-dUTP、生wu素-dUTP）は、直接その場検出を行うことができ、より迅速で直接的な検出手段である。

本キットは応用範囲が広く、凍結またはパラフィン切片中の細胞アポトーシス情況を検出することができ、培養した壁貼り細胞または懸濁細胞のアポトーシス情況を検出することもできる。壊死細胞や照射や薬物治療によるDNA鎖断裂細胞ではなく、アポトーシス細胞を選択的に検出することができる。本キットは細胞アポトーシスを検出し、時間が短く、染色反応を1ステップだけ行い、洗浄後に検出することができる。

使用方法

じっけんざいりょう

PBS緩衝液（pH ~ 7.4）

0.4%TritonX-100（PBS処方）

4%パラホルムアルデヒド（PBS配合）

免疫化ペン

脱蝋溶媒（パラフィン切片サンプル）

パラフィン切片処理関連試薬

蛍光消光防止封止錠剤

にじじょうりゅうすい

実験デザイン

A.陽性対照

DNaseI処理により陽性対照スライドを作製した。DNase 実験のたびに1回やればいい。（今回の実験操作とキットの問題の有無を検証するために使用）

B.陰性対照

TdTを含まない EnzymeのTUNEL 反応 Buffer，TdTの代わりにddH 2 Oを用いる Enzyme。（主に細胞自体のアポトーシス、操作過程などの原因による非特異的染色の排除、及び撮影露光強度の調整である。）

C.実験処理グループ

実験グループは説明書に従って正常に動作した。

D.実験対照群

実験グループは説明書に従って正常に動作した。

実験手順

1、サンプルの準備：

（1）壁貼り細胞又は細胞塗布シートに対する

注：細胞コーティングされた細胞の密着性が懸念される場合は、サンプルを乾燥して細胞をより強固に密着させることができます。

b.固定：4%ポリホルムアルデヒド（PBS調製）を適量添加し、4℃で30 min固定する。PBS洗浄2回。

c.透過：0.4%TritonX-100（PBS調製）を適量添加し、室温で20 min透過する。PBS洗浄2回。

d.回転ステップ2.TUNEL反応。

（2）懸濁細胞又は細胞懸濁液に対する

a.収集細胞（3−5×10⁶個の細胞）、1000 rpmで5分間遠心分離し、PBSで2回洗浄した。

2000 rpm遠心5 min、PBS洗浄2回。

c.透過：0.4%TritonX-100（PBS調製）を適量添加し、室温で20 min透過する。2000 rpm遠心5 min、PBS洗浄2回。

d.回転ステップ2.TUNEL反応。

（3）パラフィン組織切片

a.パラフィンスライスをスライス棚に置き、60℃オーブンで60 min焼く。

b.脱蝋と水化：スライスサンプルをキシレンI（10 min）キシレンII（10 min）100%エタノールI（5 min）100%エタノールII（5 min）95%エタノール（5 min）90%エタノール（5 min）80%エタノール（5 min）70%エタノール（5 min）ddH 2 Oに順次入れて5分間洗浄し、2回洗浄する。

注：キシレンは有毒で揮発性があるので、通風ケースでこの操作を行ってください。

c.切片試料の周囲の液体を濾紙で吸引し、下流が透過し標識されるように免疫グループ化ペンで試料輪郭を囲む。

d.透過：2 mg/mLのProteinase K溶液を1：50の割合でPBSで最終濃度40µg/mLに希釈し、各サンプルに100µLを滴下し、溶液を全サンプル領域を覆い、37℃で30 minインキュベートした。

注：Proteinase Kは細胞膜と核膜を透過することができ、それによって次のステップの染色試薬を十分に細胞核に入れて反応させ、標識効率を高める。インキュベーション時間が長すぎると、組織スライスが後続の洗浄工程でキャリアシートから脱落するリスクが増加し、短すぎると透過性処理が不十分になり、マーキング効率に影響を与える可能性がある。より良い結果を得るためには、Proteinase Kの濃度、インキュベーション時間、温度は異なるタイプの組織サンプルに基づいて最適化される必要があります。

e.スライスサンプルを1×PBSに3回浸漬し、毎回5 min、濾紙で余分な液体を吸引し、処理したサンプルを湿潤箱に入れて湿潤を維持する。

注：このステップではProteinase Kをきれいに洗浄しなければならない。そうしないと、後続のマーキング反応が深刻に妨げられる。

（4）凍結組織切片

a.固定：凍結スライスを取り出し、室温に戻します。スライスサンプルを4%ポリホルムアルデヒド（PBS調製）に浸漬し、室温で30 min固定した。スライスサンプルを1×PBSに3回浸漬し、毎回10分間すすぎます。

注：ホルムアルデヒドの洗浄が不潔で、最終的な染色効果に影響することを心配する場合。ホルムアルデヒドの固定が完了した後、適量の2 mg/mLグリガン酸を加えて10分間洗浄し、残留した固定液を中和し、PBS洗浄を行うことができる。

b.切片試料の周囲の液体を濾紙で吸引し、下流が透過し標識されるように免疫グループ化ペンで試料輪郭を囲む。

注：後続の実験操作で免疫グループ化された筆画の輪郭圏が破壊されたことが発見された場合、直ちに補画する必要がある。

c.透過：2 mg/mLのProteinase K溶液を1：50の割合でPBSで最終濃度40µg/mLに希釈し、各サンプルに100µLを滴下し、溶液を全サンプル領域を覆い、37℃で20 minインキュベートした。

注：Proteinase Kは細胞膜と核膜を透過することができ、それによって次の工程の染色試薬を使用することができる。（1）：Proteinase K：（2）：（2）：（2）：（3）：（3）：（3）：（3）：（3細胞核に十分に入り込んで反応し、標識効率を高める。インキュベーション時間が長すぎると、組織スライスが後続の洗浄工程でキャリアシートから脱落するリスクが増加し、短すぎると透過性処理が不十分になり、マーキング効率に影響を与える可能性がある。より良い結果を得るためには、Proteinase Kの濃度、インキュベーション時間、温度は異なるタイプの組織サンプルに基づいて最適化される必要があります。Proteinase Kの濃度とインキュベーション時間を最適化しても染色効果を改善できない場合は、サンプルを1%TritonX-100（PBS調製）に浸漬し、室温で3-5 min浸透させることができる。その後、スライスサンプルを1×PBSに3回浸漬し、毎回5分間すすぎます。

d.スライスサンプルを1×PBSに3回浸漬し、毎回5 min、濾紙で余分な液体を吸引し、処理したサンプルをウェットボックスに入れて湿潤を維持した。

注：このステップではProteinaseKをきれいに洗浄しなければならない。そうしないと、後続のマーキング反応が深刻に妨げられる。

e.回転ステップ2.TUNEL反応。

（5）陽性処理（陽性対照のみこの工程を行い、他のサンプルは直接TUNEL反応工程を行う）

a.10×DNase I Bufferを1：10の割合でddH 2 Oで1×DNase I Bufferに希釈してバックアップする。

b.処理したサンプルに100µL 1×DNase I Bufferを滴下し、すべてのサンプル領域を覆い、室温で5分間平衡する。

d.Bufferを捨て、100μL濃度20 U/mLのDNaseI作動液を加え、室温で15分間インキュベートした。

e.DNase I作動液を捨て、PBSで2回洗浄する。

f.回転ステップ2.TUNEL反応。

2、TUNEL反応

（1）TUNEL反応液の調製（即ち即配）

a.各サンプルに50μLのTUNEL反応液を添加し、反応液をサンプルを均一に被覆した。37℃の遮光インキュベーションに適した時間（細胞推奨染色時間15〜30 minh、組織染色時間推奨1 h）。

注：50μL TUNEL反応液は塗布、スライスまたは96ウェルプレートに適している（他の異なるウェルプレートは適切にTUNEL反応液の体積を調整でき、細胞を被覆すればよい）。検査するサンプルが塗布シート、スライスまたは24ウェルプレート、12ウェルプレートまたは6ウェルプレートであれば、蒸発防止フィルムを使用したり、自己封止袋または他の適切な材料を使用して自己裁断を試みて穴よりやや小さい円形プラスチックシートに裁断したり、TUNEL反応液を滴下してサンプルに被覆したりすることができ、TUNEL反応液の蒸発を防止し、TUNEL反応液を均一にサンプルを被覆することができる。

b.TUNEL反応液を捨て、PBSで2回洗浄した後、0.1% テリー同 X-100 （5 mg/mLBSAを含むPBS配合）を3回洗浄し、毎回5 minで、このように遊離した未反応の標識物は比較的きれいに除去することができる。

c.（オプション）各サンプルに適量濃度5μg/mLのDAPI染色液を添加し、室温で光を避けるインキュベーション5min。染色完了後、DAPI染色液を捨て、PBS洗浄を2回、毎回5 min行った。

d.（オプション）スライス封止シート：各サンプルに20μLの抗蛍光クエンチ封止剤（抗蛍光クエンチング封止錠剤は一部の染料に適用されない可能性があり、実験前に事前実験試験のマッチングを提案する。（1）：クエンチング封止錠剤は一部の染料に適用されない可能性がある。（1）：（2）：（3）：（3性）、カバーガラスをかぶせ、ピンセットの鈍端でカバーガラスを軽く叩き、気泡を除去してシールwan全（ぜん）。

e.濾紙で余分な液体を吸い取り、サンプル領域に100μL加える PBSはサンプルの湿潤を維持し、直ちに蛍光顕微鏡下で観察した。

（3）懸濁細胞又は細胞懸濁液について

a.各サンプル管に50μLTUNEL反応液を添加して細胞を軽く再懸濁し、37℃で光を避けてインキュベートする15-30min。10分ごとに微量ピペットを用いて細胞を軽く再懸濁した。

b.2000 rpmで5 min遠心分離し、TUNEL反応液を捨て、0.1% テリー同 X-100（5 mg/mLを含むPBS配合 BSA）洗浄2回、毎回5 min、このように泳ぐ離した未反応の標識物は比較的きれいに除去することができる。

c.各サンプル管に100μL濃度5μg/mLのDAPI染色液を添加し、室温で5分間光を避けてインキュベートした。

d.400μL添加 PBS再懸濁細胞は、直ちにフローサイトメータで検出または塗布を行った後、蛍光顕微鏡下で観察する。

注意事項

1.使用前に製品を瞬時に管底まで遠心分離し、その後の実験を行ってください。

2.染色背景が重い場合や非特異的な着色が明らかな場合は、染色時間を適切に減らすことができる。

4.成分Aを使用する場合は、マスク、手袋を着用してください。肌に触れる場合は、すぐに大量の水で洗い流してください。

5.蛍光染料はいずれも消光問題があるので、できるだけ遮光に注意して、蛍光消光を遅らせてください。

6.本製品は科学研究に限られ、臨床診断や治療に使用してはならず、食品や薬品に使用してはならず、一般住宅に保管してはならない。

7.安全と健康のために、実験服を着て使い捨て手袋をはめて操作してください。