核酸抽出装置

TriZol総RNA抽出試薬

製品番号：1000ランド

保管条件：TriZol総RNA抽出試薬室温で12ヶ月間安定して保存できます。保存することをお勧めします2 ~ 8°Cの環境下。

重要なヒント：

本品にはフェノールが含まれ、毒性と腐食性がある。体内に吸い込んだり、皮膚に触れたり、飲み込んだりすると中毒ややけど、その他の身体的ダメージを招くことがあります。うっかり接触した場合は、すぐに大量の水で洗い流し、病院に行って治療しなければならない。

製品紹介：

TriZol総RNA抽出試薬広範なスペクトル型総RNA抽出試薬である。実験操作は迅速で便利で、色が鮮明で、階層化に便利である。本試薬の適用範囲は広く、動物組織、植物材料、各種微生物及び培養細胞などのサンプルから総RNAを抽出することができる。この方法は少量の組織（50〜100 mg）と細胞（5×106）及び大量の組織（≧1 g）と細胞（>107）に対して比較的に良い分離効果がある。試料はTriZol総RNA抽出試薬中で十分に分解されながら、RNAの完全性を可能な限り保証することができる。クロロホルムを加えて遠心分離すると、溶液は3層に分けられる：上層の無色水相、中間層と下層の赤色有機相、RNAは上清層に分布する。上澄み層を収集した後、イソプロパノール沈殿により全RNAを回収することができる。抽出された総RNAは完全性が良く、蛋白質とDNA汚染がなく、各種分子生物学の通常の実験に用いることができ、例えばRT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern blot、Dot Blot、体外翻訳など。

例えば、ラット肝臓から抽出したRNAアガロースゲルを電気泳動し、臭化エチルジンで染色すると、7 kbと15 kbの間に不連続な高分子量ストリップ（mRNAとhnRNA成分）が多く、2つの優位性リボソーム~ 5 kb（28 S）と~ 2 kb（18 S）、低分子量RNAが0.1と0.3 kbの間（tRNA、5 S）であることが分かった。抽出したRNAをTEで希釈すると、そのA 260/A 280比は≧1.8となる。注意通常のアガロースゲル電気泳動であれば、28 Sの位置は約2 kb、18 Sは約1 kbであり、異なる濃度のゲル位置の変化が大きい。

注意事項：

1.サンプル用TriZol総RNA抽出試薬のホモジナイズ後、直ちにクロロホルムを添加する前に、−70°C下に置くと1ヶ月以上放置することができる。75%エタノール中に保存されたRNA沈殿物は、2〜8°Cで1週間、−20°Cで1年間保存することができる。RNA半減期は比較的短く、分解しやすいので、抽出後、cDNA、Northern Blotなどに逆転写するなど、できるだけ早く後続の実験を行うことをお勧めします。

3.自己準備試薬：クロロホルム、イソプロパノール（新規開封または抽出RNA専用）、75%エタノール（DEPCで処理した水で調製）、RNase free waterまたはDEPCで処理した水。

4.当社製TriZol総RNA抽出試薬Reagentは品質が優れており、InvitrogenのTrizol Reagentに代わることができる。抽出品質は下流実験*と同じである。

RNA抽出操作手順：（実験前に注意事項を読んでください）

ヒント：

用いるTriZol総RNA抽出試薬のRNA抽出時には手袋と眼帯を着用する。肌や服に触れるのを避ける。気道吸入を避ける。特に説明がない限り、すべての操作は15 ~ 30℃の室温条件で行うべきである。

1.ホモジナイズ

a.植物組織：

新鮮な植物組織を採取して液体窒素中で十分に研磨するか、植物組織を処理して砕いた後、TriZol総RNA抽出試薬中で急速に研磨し、組織50 ~ 100 mgごとに1 mlのTriZol総RNA抽出試薬を加え、混合した。注意：試料体積は一般的にTriZol総RNA抽出試薬体積の10%を超えてはならない。

b.動物組織：

−70℃で凍結保存した動物組織はできるだけ切断し、30−100 mgの組織ごとに1 mlのTriZol総RNA抽出試薬を添加し、ホモジナイザはホモジナイザー処理を行った。または液体窒素中で研磨した後、TriZol総RNA抽出試薬1 mlを加えて混合する。注意：試料体積は一般的にTriZol総RNA抽出試薬体積の10%を超えてはならない。

c.単層培養細胞：

残留培養液をできるだけきれいに除去した後、直接直径へ3.5 cmの培養プレートに1 mlのTriZol総RNA抽出試薬を添加して切断細胞を被覆し、繰り返し吹き付けた。必要なTriZol総RNA抽出試薬量は、細胞の数ではなく、培養プレートの面積に基づいて決定される（10 cm 2当たり1 ml加える）。TriZol総RNA抽出試薬量が不足すると、抽出されたRNAにDNAが汚染される可能性がある。

注意：

壁貼り培養細胞は培養瓶（皿）から脱落できないことがよくあり、これは分解できないことを意味しない。この時、細胞膜は実際に*破裂し、すべて放出されたRNA，続けてやればいい。

d.細胞懸濁液：

にTriZol総RNA抽出試薬試薬中にピペットを用いて分解細胞を繰り返し吹き込んだ。5 ~ 10×毎10⁶の動物細胞、植物または酵母細胞、または1×107細菌あたり1 mlのTriZol総RNA抽出試薬。mRNA分解の可能性が高まるため、TriZol総RNA抽出試薬を添加する前に細胞を洗浄することを避けるべきである。破裂した酵母菌や細菌の中には、ホモジナイザーを使用する必要がある場合があります。

f.血液：

使用するTriZol総RNA抽出試薬試薬LS

2.均質試料を激しく振動させた後、室温条件下で放置した5分間で核蛋白体*を解離させた。

3.オプションのステップ：

に4°Cの条件下で12000 rpmの遠心力で10分間遠心分離し、清を取る。

例えば、サンプルに多くの蛋白質、脂肪、多糖類または筋肉、植物の塊茎結節などが含まれている場合は遠心的に除去することができる。遠心分離後の沈殿には細胞外膜、多糖類、及び高分子量が含まれるDNA，脂肪組織のサンプルを処理する場合、上層部は大量の油脂を除去しなければならない。清澄なスラリーを取って次のステップに進みます。

4.毎1mlTriZol総RNA抽出試薬クロロホルム0.2 mlを加える。チューブカバーをしっかりと閉め、15秒間激しく振動させ、室温で2 ~ 3分間放置した。

5.に遠心分離後の混合物は3層に分けられる：下層の赤色有機フェノールクロロホルム層、中間層、上層の無色の水様層。RNAは例外なく水様層中に存在する。水サンプル層の容量は、添加されたTriZol全RNA抽出試薬の容量の約50〜60%である。（有機層と中間層は蛋白質とDNAであり、抽出が必要な場合は抽出方法をご連絡ください）。

6.水サンプル層をきれいな遠心管に移し、等体積イソプロパノールを加える。逆混和後の室温放置10分です。

RNA沈殿は遠心前には通常見られず、遠心後に管側と管底にコロイド沈殿を形成する。

7.室温または

8.加入75%エタノール洗浄沈殿。沈殿物を1 mlのTriZol総RNA抽出試薬を用いて1 mlの75%エタノールで洗浄した。

9.室温または4°C 12000 rpmは3分間遠心分離し、上清を捨て、RNA沈殿を失わないように注意する。

注意：残りの少量の液体は一時的に遠心分離することができて、それから銃の頭で吸い出して、沈殿物を吸い捨てないように注意します。

10.室温配置2 ~ 3分、乾かします。30〜100μlのRNase free waterを加え、RNAを十分に溶解し、得られたRNAは−70℃に保存し、分解を防止した。

注意：残りの少量の液体は一時的に遠心分離することができて、それから銃の頭で吸い出して、沈殿物を吸い捨てないように注意します。