モジュラス生物ヒト小腸類器官培地セット

ヒト腸管器官キット

ヒト小腸系器官培地セット

1、 製品説明

模基生物ヒト小腸類器官培養キット（ヒト腸管器官キット）はヒト腸管成体幹細胞の源を確立し維持するための小腸類器官培地セットであり、このキットは小腸窩分離、窩回収、窩活性分析及び培養の完全な試薬セットを提供している。小腸かくれの活性を大きく維持し、小腸類器官の形成率を高めることができ、培養された人小腸類器官は主に小腸幹細胞、急速増幅細胞、腸吸収細胞、潘氏細胞、カップ状細胞と少量の腸内分泌細胞から構成され、自己の更なる新能力、組織構造、細胞タイプと機能の面で、人小腸類器官は部分的に人腸上皮の特徴を再現することができ、そのため腸の定常状態と疾病機序研究の理想的な体外モデルである。

2、 製品情報

3、 その他の自己準備材料と試薬

4、 ヒト小腸系器官培地の調製

無菌超清浄作業台にヒト小腸系器官培地を調製した。に割り当てる10mLヒト小腸類器官培地は、例えば、必要量が異なる場合には、それに応じて使用量を調整することができる。

1、 氷上解凍ヒト小腸類器官培養因子B（50倍）、ヒト小腸類器官培養因子C（250倍）、ヒト小腸類器官培養因子D（250倍）。

注意：解凍後、ヒト小腸類器官培養因子B（50倍）、ヒト小腸類器官培養因子C（250倍）。別々に分けてから、凍結融解を繰り返しないように保存して使用する。

2、 培地を解凍した後、上下を逆さまにして十分に混合し、生物安全キャビネットまたは清潔作業台の中で日常の需要量に応じて分注し、分注することを推薦する10mL/パイプ。

3、 分装後の培地は密封して保管してください-20℃、使用時に分装した培地を取り出して室温平衡に置いてから使用することができる。

注意：調製後のヒト小腸類器官培地は2-8摂氏度ストックして、2週間以内に使用することをお勧めします。また、ヒト小腸系器官培養因子B（50倍）細菌及び真菌抗生物質を含む（50倍）。

5、 ヒト小腸類器官の確立と継代培養

注意：主要な人体組織材料に関する研究は、関連するすべての機関と政府法規に従わなければならない。主要な人体組織材料を収集する前に、すべての被験者の同意を得なければならない。

一 旧世代の小腸類器官の構築

1、 サンプリング：遠心管を用いて先代人小腸組織を冷たい先代組織保護液に収集し、組織サンプルを4°C、分離が始まるまで。

2、 クリーニング：組織サンプルを冷房前インストールに転送するDPBS緩衝液の培養皿では、腸腔面を上向きにし、一方の手では腸組織の端を挟み、もう一方の手では片を用いて腸腔面の腸絨毛を軽く掻き取り、腸絨毛が掻き取られた後、腸組織を新しい含DPBSの培養皿で洗浄し、繰り返し洗浄する2回。洗浄後の小腸を砕く2mm新しいシャーレに移し、DPBS洗浄2遍。

3、 消化：洗浄した腸の部分を含有に移す5mM/L EDTAの予冷DPBSに置く4℃または砕氷中でのインキュベーション20～30分、消化20分左右は移液器を用いて腸段を優しく吹き付け、上清顕微鏡を取って観察し、上清に完全な巣が出現すると消化を中止することができ、巣がなければ適切に消化時間を延長することができる。

4、 洗浄：消化が完了したら、組織フラグメントを新しい含浸に移すDPBSの培養皿で洗浄、繰り返し2削除するエチレンジアミン四酢酸。

5、 オーバーハングオーバー：用5mLピペットは予冷されている0.1%ウシ血清アルブミンのDPBSの培養皿又は50mL遠心管に組織破片を吹き付け、再懸濁させ、組織をピペットの先端を繰り返し通過させて機械的せん断力を発生させ、かくれと基底層を分離させ、一部の懸濁液鏡を取って検査し、大量のかくれ様構造を見ることができたら、吹き付けを停止し、吹き付け後の組織懸濁液に対して実行する70ミクロン濾過網で濾過する。

6、 収集：濾過網を通した組織懸濁液を収集し、300グラム遠心力4℃遠心3分。

7、 カウントカウントカウント：上清を破棄、使用1 mL 0.1%ウシ血清アルブミンのDPBS重懸濁組織沈殿、採取20μL懸濁液は鏡検査と隠れ家計数を行い、計数完了後に必要な隠れ家量を含む懸濁液を吸引し、300グラム遠心力4℃遠心3分、清を捨てて氷の上に置く。

8、 適量の基質ゲルを用いて組織沈殿を再懸濁し、再懸濁密度は10μLマトリックスゲル懸濁液は、70まで100個の隠れ家、再びぶら下がって氷の上に置いて、再びぶら下がる時間は超えません30秒マトリックス接着剤が早期に凝固しないようにする。

注意：基質接着剤の希釈比率は70%以上により、培養中のマトリックスゲルの構造安定性を保証した。

9、 マトリックスゲルと組織細胞の混合懸濁液を点入24オリフィスプレートの底部は正で、各オリフィス30μL左右に、穴板側壁に懸濁液が接触しないようにします。の10.接種完了後の培養プレートを37℃二酸化炭素恒温培養箱において、インキュベーション30分マトリックスゲルを左右に凝固させる。

10、 マトリックスゲルが凝固した後、壁に沿ってゆっくりと調製されたヒト小腸類器官培地を加え、24オリフィスプレート毎の穴500マイクロリットルを選択し、凝固した構造物を破壊しないようにします。

11、 将（しょう）24オリフィスプレートの配置37℃二酸化炭素培養箱で培養する。

12、 毎2~3培地を1日1回交換し、培地を交換する際にマトリックスゲルを破壊しないようにしなければならない。類器官の成長状態を密接に監視し、理想的には、ヒト小腸類器官は5まで7日以内に完成する。

b ヒト小腸類器官の継代培養

1、 人に接する小腸類器官は直径が200～500μm大時間（あるいは黒くなって増大しなくなった時）、人の小腸類器官の継代（世代ごとに約5日くらい）。洗浄液で洗浄した銃頭を吹きつけて洗浄器官を掻き取り、小腸器官と培地懸濁液を洗浄液で洗浄したものに移した1.5mLEPチューブの中。

2、 潤洗液で潤洗された銃頭で重懸濁類器官懸濁液を強く吹き、複数回吹きつけた（5~10次）小腸類器官と基質ゲルを分離して吹き、300グラム遠心3分。

3、 清らかになる1mL基礎培地再吹打系器官5~10回、少量の懸濁液鏡を採取して類器官の状態を検査観察する：

1) 類器官が破片に分散している場合は、分散器官を機械的に吹き付けてから直接300グラム遠心3分、遠心分離後に使用公共放送サービス又は基礎培地洗浄2回。

2) もし種類の器官が比較的に完全であれば300グラム遠心3分後に、上清を捨てて、参加します5マトリックスガムとヒト小腸系器官混合物の体積の倍の種類器官消化液を、均等に吹き付けて混合した後、37℃培養箱中の消化2分間を選択します。5消化液の体積の倍の基礎培地は消化を停止する。遠心分離後の使用公共放送サービス又は基礎培地洗浄2回。

4、 適量の基質ゲルを用いて洗浄後の類器官沈殿物を再懸濁し、再懸濁後氷上に置き、再懸濁時間は超えない30秒マトリックス接着剤が早期に凝固しないようにする。

注意：基質接着剤の希釈比率は70%以上により、培養中のマトリックスゲルの構造安定性を保証した。

5、 マトリックス接着剤とクラス器官の混合懸濁液を点入する24オリフィスプレートの底部は正で、懸濁液がオリフィスプレートの側壁に接触しないようにして、各オリフィス30μL左右。

注意：マトリックスゴムの室温凝固を防止するために、このステップはできるだけ早く完成しなければならない。

6、 接種完了後の培養プレートを37℃二酸化炭素恒温培養箱において、インキュベーション15分マトリックス接着剤を左右に固めて取り出します。

7、 ヒト小腸系器官培地を調製する。

8、 マトリックスゲルが凝固した後、孔壁に沿って事前に予熱したヒト小腸類器官培地を添加し、24オリフィスプレート毎の穴500マイクロリットル。

9、 細胞培養プレートを入れる37℃培養箱で培養し、ヒト小腸類器官の成長状態を密接に観察し、3日に倒置顕微鏡下で写真を撮り、複数の視野におけるヒト小腸類器官の形態と分布を記録した。

V2.0版

更新日時：2025/6/17