モジュラス生物ヒト結腸系器官培養培地セットPlus（増幅）

ヒト結腸系器官キットPlus（拡張）

ヒト結腸系器官培地セット加（増幅）

1、 製品説明

モジュラス生物ヒト結腸類器官培地セット加（増幅）【ヒト結腸系器官キットアップグレード版（拡張版） 加】ヒト結腸系器官を増幅するための培地であり、増幅時のヒト結腸系器官は主に結腸幹細胞と結腸祖先細胞からなる。結腸類器官は自己更新と分化能力、組織構造、細胞タイプと機能の面で、体内結腸上皮の特徴を再現したので、人結腸研究の理想的な体外モデルである。

2、 製品情報

3、 その他の自己準備試薬と消耗品

4、 ヒト結腸系器官培地（増幅）の使用説明

1、 臓器培地を受け取った後、培地を4℃で冷蔵庫を解凍する。

2、 培地を解凍した後、上下を逆さまにして十分に混合し、生物安全キャビネットまたは清潔作業台の中で日常の需要量に応じて分注し、分注することを推薦する10mL/パイプ。

3、 分装後の培地は密封して保管してください-20℃、使用時に分装した培地を取り出して室温平衡に置いてから使用することができる。

5、 ヒト結腸類器官の確立と継代培養

注意：旧世代の人体組織材料に関する研究は、関連するすべての機関と政府法規を遵守しなければならない。主要な人体組織材料を収集する前に、すべての被験者の同意を得なければならない。

一 旧世代の結腸系器官の構築

1、 旧世代組織サンプルはオフサイトにあるべきである5分予冷した活組織保存液（2-8℃）のサンプルチューブでは、サンプルは生体組織保存液で覆われている必要があります（サンプルがすでに他の緩衝液や培地に置かれている場合は、溶液全体を予冷生体組織保存液で置換してください）。低温（2~8℃）輸送を実験室に移す。

2、 実験前にマトリックスペーストを放置する4℃氷の上で解凍し、同時に培地を取り出して室温平衡に置く。細胞と接触する遠心管、試験管またはプラスチック吸入ヘッドは、類器官培養による接着防止洗浄液で洗浄した後に使用する必要がある。

3、 クリーンテーブルでは、サンプルをシャーレに移し、得られた組織が上皮からなるかどうかを評価した。脂肪や筋肉組織がある場合は、解剖顕微鏡下でナイフやピンセットを使用して、これらの非上皮成分をできるだけ多く除去してください。脂肪や筋肉組織がない場合は、すぐに次のステップに進みます。

4、 組織サンプルをプリクール含浸デュアルリアクタンスに移行するDPBSの培養皿では、腸腔面を上にし、一方の手では腸組織の一端を挟み、他方の手では片を用いて腸腔面の粘液や残留した糞を軽く掻き取り、次いで結腸組織を新しい含双抗DPBSのシャーレ内洗浄2-3回。洗浄後の腸を約2mm*5mmサイズ、次に移動50mL遠心管中、激しい振動30秒（垂直上下振動20一回ずつ計算して、約1s三回)上清を捨てる、繰り返す3回。

5、 消化：添加30mLのDPBS溶液に加えて300μL 0.5 Mエチレンジアミン四酢酸、までエチレンジアミン四酢酸最終濃度は5mMを選択します。4℃ロッキングベッドには、80回転/分、消化20～30分（試料の量に応じて、消化20分の間に均等に吹き付けた後、鏡の下で消化状況を観察し、完全な隠れ家構造が観察されれば次の操作を行うことができる）。

6、 洗浄：消化が完了した後、腸段沈殿を静置し、上清を廃棄する。予冷を加えるDPBS、柔らかく均一に揺れ、静置後に清を捨て、繰り返し2削除するエチレンジアミン四酢酸。

7、 オーバーハングオーバー：追加30mL予冷の含有量0.1%ウシ血清アルブミンのDPBS、渦10秒、上清を取る100ミクロン濾過網で濾過し、濾過網を通した組織懸濁液を収集し、繰り返し収集する2回。

8、 収集：300グラム遠心力4℃遠心3分。

9、 上澄み液を吸引廃棄し、沈殿物を上皮類器官基礎培地に再懸濁し、懸濁液を採取して隠れ家計数を行った。

10、 300グラム遠心力4℃遠心3分、上澄み液を吸引・廃棄し、培養需要に応じて適量の細胞沈殿物を採取してマトリックスゲル（>70%）と氷の上で均等に混ぜる（注意：均等に混ぜて打つ動作は柔らかくて、大量の気泡を発生してはいけなくて、常温で均等に混ぜるのは制御する必要があります15秒以内)、混ぜて氷の上に置く。注：マトリックスゴムは氷の上に保存して凝固を防止しなければならない。できるだけ早くこのプロセスを行います。およそ50個の隠れ家に接種すべき25μLマトリックスゴム中。マトリックスペーストを過度に希釈しないこと（マトリックスペーストの割合応>70%（マトリックスゴム体積/これにより、固体液滴の正確な形成が抑制される可能性があるため、全体積））。

11、 基質ゲルと細胞の混合懸濁液を培養孔板の底部に点入し、銃頭を用いて懸濁液を少し平らにし、懸濁液が孔板の側壁に接触しないように注意する。（推奨：96オリフィス接種3~10μL/穴、48オリフィス接種10~20μL/穴、24オリフィス接種20~30μL/穴)。

12、 注意：基質系器官が基質接着剤に再懸濁すると、基質接着剤が試験管またはピペットの吸込頭で凝固する可能性があるため、できるだけ早く種板を行う。

13、 培養プレートを入れる37℃和5%一酸化炭素₂の培養箱に15-25分、マトリックスゲルを凝固させる。

14、 マトリックスゲルが凝固した後、壁に沿って室温平衡の臓器培地をゆっくりと加え、凝固構造の破壊を回避した。（推奨：96オリフィスプレート添加100μL/穴、48オリフィスプレート添加250マイクロリットル/穴、24オリフィスプレート添加500マイクロリットル/穴)。注：凝固した構造を破壊する可能性があるので、培地を直接マトリックスゲル液滴の上部に添加しないでください。

15、 培養プレートの配置37℃和5%一酸化炭素₂の恒温培養箱に入れた。

16、 毎に2~3培地を1日1回交換し、細孔から培地を慎重に吸引し、新鮮な室温平衡型器官培地を加えた。

17、 類器官の成長状態を密接に監視する。

b ヒト結腸類器官の継代培養

1、 待機器官は直径が600ミクロン大きい時間（あるいは黒くなって増大しなくなった時）、類器官の継代（世代ごとに約1週）。以下の操作で細胞と接触する消耗品はいずれも潤洗液で潤洗した後に使用する必要がある：

2、 旧培地を吸引・廃棄し、等体積上皮類器官基礎培地を添加し、細胞ドクターブレードまたはピペット吸引ヘッドを用いて基質ゲルと類器官混合物を軽く掻き（または吹き付け）、1.5ミリリットル遠心管（1管あたり最大収集2~3孔類器官、体積が大きすぎて消化効率が低いことを避ける)、吹き付け5~10次に、類器官と基質ゲルを分離し、300グラム遠心3分です。

3、 上澄み除去添加5基質ガムと臓器混合物の体積の倍の臓器消化液を、均等に吹き付けて混合した後、37℃培養箱中の消化3分です。取り出してふき混ぜて、取ります10μL混合液鏡検査で消化されたかどうか300ミクロン左右器官団塊。

注：次のステップで再懸濁沈殿するには吹打力度と回数を制御する必要があり、種類器官の塊が大きさに制御されることである300ミクロン左右。

4、 消化が完了したら、5倍体積上皮類器官基礎培地を柔らかく吹き込んで混合して消化反応を停止し、その後250グラム遠心3分です。

5、 上澄み液を吸引・廃棄し、上皮類器官基礎培地で洗浄する2次に、残った消化液を除去する。二次洗浄は、同じ遠心管に類縁器官を統合して収集することができる。

6、 洗浄完了後、遠心沈殿中の細胞を継代培養し、細胞沈殿中にマトリックスゲル（>70%）と氷の上で均等に混ぜる（注意、均等に混ぜて打つ動作は柔らかくて、大量の気泡を発生してはいけなくて、常温で均等に混ぜるのは制御する必要があります15秒以内)、混ぜて氷の上に置く。注意：基質接着剤の希釈比率は70%以上により、培養中のマトリックスゲルの構造安定性を保証した。

7、 基質ゲルと細胞の混合懸濁液を培養孔板の底部に点入し、銃頭を用いて懸濁液を少し平らにし、懸濁液が孔板の側壁に接触しないように注意する。（推奨：96オリフィス接種3~10μL/穴、48オリフィス接種10~20μL/穴、24オリフィス接種20~30μL/穴)。およそ50個の臓器集団接種は25μLマトリックスゴム中。注意：マトリックスゴムの室温凝固を防止するために、このステップはできるだけ早く完成しなければならない。

8、 培養プレートを入れる37℃和5%一酸化炭素₂の培養箱に15-25分、マトリックスゲルを凝固させる。

9、 マトリックスゲルが凝固した後、壁に沿って室温平衡の臓器培地をゆっくりと加え、凝固構造の破壊を回避した。（推奨：96オリフィスプレート添加100μL/穴、48オリフィスプレート添加250マイクロリットル/穴、24オリフィスプレート添加500マイクロリットル/穴)。注：凝固した構造を破壊する可能性があるので、培地を直接マトリックスゲル液滴の上部に添加しないでください。

10、 培養プレートの配置37℃和5%一酸化炭素₂の恒温培養箱に入れた。

11、 毎に2~3培地を1日1回交換し、細孔から培地を慎重に吸引し、新鮮な室温平衡型器官培地を加えた。

12、 類器官の成長状態を密接に監視し、類器官が次の実験を行う必要があるまで。

V2.0版

更新日時：2025/6/12