ヒト気管系器官培地セットPlus

ヒト気道系器官キットPlus

ヒト気管系器官培地セット加

1、 製品説明

モジュラス系生物気管系器官培養キット（ヒト気道系器官キットPlus）は、ヒト気管幹細胞から誘導されるヒト気管系器官を確立し維持するための化学的に定義された細胞培地である。気道上皮の自己更新は基底幹細胞の増殖によって駆動される。ヒト気管系器官は基底細胞、繊毛細胞、分泌細胞と少量の神経内分泌細胞を含むため、器官は体系構造、細胞型組成と自己更新動力学の面で気道上皮のすべての特徴を示し、そのため気道発育と疾病研究に対して巨大な潜在力を持っている。

2、 製品情報

3、 その他の自己準備材料と試薬

4、 ヒト気管系器官培地の使用説明

1、 臓器培地を実際に受け取った後、培地を4℃冷蔵庫を解凍する、

2、 培地を解凍した後、上下を逆さまにして十分に混合し、生物安全キャビネットまたは清潔作業台の中で日常の需要量に応じて分注し、分注することを推薦する10mL/チューブ

3、 分装後の培地は密封して保管してください-20℃、使用時に分装した培地を取り出して室温平衡に置いてから使用することができる。

5、 ヒト気管系器官の確立と継代培養

注意：旧世代の人体組織材料に関する研究は、関連するすべての機関と政府法規を遵守しなければならない。主要な人体組織材料を収集する前に、すべての被験者の同意を得なければならない。

一 旧世代の気管系器官の構築

1、 旧世代組織サンプルはオフサイトにあるべきである5分予冷した活組織保存液（2-8℃）のサンプルチューブでは、サンプルは生体組織保存液で覆われている必要があります（サンプルがすでに他の緩衝液や培地に置かれている場合は、溶液全体を予冷生体組織保存液で置換してください）。低温（2~8℃）輸送を実験室に移す。

2、 実験前にマトリックスペーストを放置する4℃氷の上で解凍し、同時に培地を取り出して室温平衡に置く。細胞と接触する遠心管、試験管またはプラスチック吸入ヘッドは、類器官培養による接着防止洗浄液で洗浄した後に使用する必要がある。

3、 クリーンテーブルでは、サンプルをシャーレに移し、得られた組織が上皮からなるかどうかを評価した。脂肪や筋肉組織がある場合は、解剖顕微鏡下でナイフやピンセットを使用して、これらの非上皮成分をできるだけ多く除去してください。脂肪や筋肉組織がない場合は、すぐに次のステップに進みます。

4、 上皮類器官基礎培地または二重抗を含むDPBS組織を2回洗浄する。

5、 ピンセットを使用した組織の移動1.5ミリリットル遠心管の中で、氷の上で無菌ので砕いて0.5~2mm²サイズ。

6、 切断した組織を使用する50倍組織体積の再懸濁を行い、15mL遠心管内では、重懸濁組織塊を吹き付ける。に37℃，100回転/分条件下の恒温揺動盤において、水平振動消化15-30分間隔10分で組織消化情況を観察し、組織塊が明らかに分散し、懸濁液が濁っている場合、適量の組織消化懸濁液を採取して鏡検査し、懸濁液中に多くの生細胞団があれば消化を中止し、もし組織塊が大きいか、消化が適切に消化時間を延長できない。消化期間は異なる規格（順序が大きいものから小さいものまで）を使用することができる10mL、5mL、1mL）のピペットを用いて組織を吹き付けて懸濁液を消化し、十分な消化を助ける。ほとんどの組織フラグメントが1mLピペットがヘッドを吸引すると、消化プロセスが完了します。

7、 将（しょう）子牛血清組織消化混合物に加え、最終濃度は2%を選択し、100ミクロン細胞フィルタろ過。

8、 濾液を収集し、4℃以下250グラム遠心3分です。可視の赤色沈殿の場合、上澄み液を吸引廃棄し、添加2mL赤血球溶解液の再懸濁沈殿、室温で赤血球を溶解1分、および4℃以下250グラム遠心3分です。

9、 上澄み液を吸引廃棄し、沈殿物を上皮類器官基礎培地に再懸濁し、4℃以下250グラム遠心3分、消化液の除去と子牛血清、遠心分離前に適量の懸濁液を用いて細胞活性測定を行うことができる。

10、 上澄み液を吸引・廃棄し、培養需要に応じて適量の細胞沈殿物を採取してマトリックスゲル（>70%）と氷の上で均等に混ぜる（注意：均等に混ぜて打つ動作は柔らかくて、大量の気泡を発生してはいけなくて、常温で均等に混ぜるのは制御する必要があります15秒以内)、混ぜて氷の上に置く。注：マトリックスゴムは氷の上に保存して凝固を防止しなければならない。できるだけ早くこのプロセスを行います。およそ10,000個の細胞は25μLマトリックスゴム中。マトリックスペーストを過度に希釈しないこと（マトリックスペーストの割合応>70%（マトリックスゴム体積/これにより、固体液滴の正確な形成が抑制される可能性があるため、全体積））。

11、 基質ゲルと細胞の混合懸濁液を培養孔板の底部に点入し、銃頭を用いて懸濁液を少し平らにし、懸濁液が孔板の側壁に接触しないように注意する。（推奨：96オリフィス接種3~10μL/穴、48オリフィス接種10~20μL/穴、24オリフィス接種20~30μL/穴)。

注意：基質系器官が基質接着剤に再懸濁すると、基質接着剤が試験管またはピペットの吸込頭で凝固する可能性があるため、できるだけ早く種板を行う。

12、 培養プレートを入れる37℃和5%一酸化炭素₂の培養箱に15-25分、マトリックスゲルを凝固させる。

13、 マトリックスゲルが凝固した後、壁に沿って室温平衡の臓器培地をゆっくりと加え、凝固構造の破壊を回避した。（推奨：96オリフィスプレート添加100μL/穴、48オリフィスプレート添加250マイクロリットル/穴、24オリフィスプレート添加500マイクロリットル/穴)。注：凝固した構造を破壊する可能性があるので、培地を直接マトリックスゲル液滴の上部に添加しないでください。

14、 培養プレートの配置37℃和5%一酸化炭素₂の恒温培養箱に入れた。

15、 毎に2~3培地を1日1回交換し、細孔から培地を慎重に吸引し、新鮮な室温平衡型器官培地を加えた。

16、 類器官の成長状態を密接に監視し、理想的には、人気道類器官は7-14日以内に完成する。

b ヒト気管系器官の継代培養

1、 待機器官は直径が100~500μm大きい時間（あるいは黒くなって増大しなくなった時）、類器官の継代（世代ごとに約1~2週）。以下の操作で細胞と接触する消耗品はいずれも潤洗液で潤洗した後に使用する必要がある：

2、 旧培地を吸引・廃棄し、等体積上皮類器官基礎培地を添加し、細胞ドクターブレードまたはピペット吸引ヘッドを用いて基質ゲルと類器官混合物を軽く掻き（または吹き付け）、1.5ミリリットル遠心管（1管あたり最大収集2~3孔類器官、体積が大きすぎて消化効率が低いことを避ける)、吹き付け5~10次に、類器官と基質ゲルを分離し、300グラム遠心3分です。

3、 上澄み除去添加5基質ガムと臓器混合物の体積の倍の臓器消化液を、均等に吹き付けて混合した後、37℃培養箱中の消化5~10分です。取り出してふき混ぜて、取ります10μL混合液鏡検査は小さい細胞塊に消化されたかどうか、消化が不十分で適切に消化時間を延長することができる。細胞カウントを要求すると単一細胞に消化する必要があり、消化時間を延長することができる10~20分後に消化バックグラウンドブルー染色を中止して細胞計数を行った。消化過程を密接に監視することで、類器官解離液中のインキュベーション時間を最短にする。

4、 消化が完了したら、5倍体積上皮類器官基礎培地を消化反応を停止するために吹き付け混合した後、250グラム遠心3分です。

5、 上澄み液を吸引・廃棄し、上皮類器官基礎培地で洗浄する2次に、残った消化液を除去する。二次洗浄により、同じ遠心管に類器を統合して収集することができる

6、 洗浄完了後、遠心沈殿中の細胞を継代培養し、細胞沈殿中にマトリックスゲル（>70%）と氷の上で均等に混ぜる（注意、均等に混ぜて打つ動作は柔らかくて、大量の気泡を発生してはいけなくて、常温で均等に混ぜるのは制御する必要があります15秒以内)、混ぜて氷の上に置く。注意：基質接着剤の希釈比率は70%以上により、培養中のマトリックスゲルの構造安定性を保証した。

7、 基質ゲルと細胞の混合懸濁液を培養孔板の底部に点入し、銃頭を用いて懸濁液を少し平らにし、懸濁液が孔板の側壁に接触しないように注意する。（推奨：96オリフィス接種3~10μL/穴、48オリフィス接種10~20μL/穴、24オリフィス接種20~30μL/穴)。注意：マトリックスゴムの室温凝固を防止するために、このステップはできるだけ早く完成しなければならない。

8、 培養プレートを入れる37℃和5%一酸化炭素₂の培養箱に15-25分、マトリックスゲルを凝固させる。

9、 マトリックスゲルが凝固した後、壁に沿って室温平衡の臓器培地をゆっくりと加え、凝固構造の破壊を回避した。（推奨：96オリフィスプレート添加100μL/穴、48オリフィスプレート添加250マイクロリットル/穴、24オリフィスプレート添加500マイクロリットル/穴)。注：凝固した構造を破壊する可能性があるので、培地を直接マトリックスゲル液滴の上部に添加しないでください。

10、 培養プレートの配置37℃和5%一酸化炭素₂の恒温培養箱に入れた。

11、 毎に2~3培地を1日1回交換し、細孔から培地を慎重に吸引し、新鮮な室温平衡型器官培地を加えた。

12、 類器官の成長状態を密接に監視し、類器官が次の実験を行う必要があるまで

V2.1版

更新日時：2025/5/27