無細胞蛋白発現キット-ジスルフィド結合増強版-凍結乾燥粉末

品番：P0243L

きおくじょうけん：-80℃，1年有効

ドライアイス輸送。開封後、無細胞タンパク質発現反応成分を−80℃に保管した。繰り返し凍結融解を避けるために、反応使用量に応じて、A液とB液をそれぞれ分装した後、液体窒素で急速凍結した後、−80℃に保管することができる。

製品説明

無細胞タンパク質合成キット（Cell−Free Protein Synthesis Kit）は、大腸菌細胞分解液に基づく体外タンパク質合成を行う製品。この製品の利用ヌクレオチド、アミノ酸、無機塩など、体外で再構成転写-翻訳システム。DNAやRNAはテンプレートであり、タンパク質を発現する。無細胞蛋白質発現は生菌に依存せず、タンパク質を迅速かつ柔軟に大量に発現することができ、従来の組換え発現システムに比べて多くの多くの利点：

1.蛋白の発現が速く、1 ~ 2 hで目的の蛋白を発現でき、8 ~ 24 hで最も達成できる大量。

3.反応が簡単で柔軟で、反応系にDNAまたはRNAテンプレートを加えるだけで、使用する96ウェルプレートまたは遠心管が反応する。

注：本商品番号の製品は通常の蛋白質を発現することができ、より適切にジスルフィド結合を含む蛋白質を発現することができる。

適用範囲

製品jinは専門家の科学研究用に限られ、臨床診断や治療に使用してはならず、食品や薬品に使用してはならない。

操作手順

1. 遺伝子構築

目的遺伝子の構築はタンパク質発現にとって重要であり、下図の構築方法を使用することを推奨する。目的の遺伝子を本キットに付属する陽性プラスミド上に構築することができる（プラスミドスペクトルの詳細は外装ラベルによるQRコード内ファイルのスキャンを参照）、すなわち以下の構築方式、pET 9 a、pET-23 aなどのT 7プロモーター含有にも対応しているが、乳糖オペレータ（lac）のPET系プラスミドは含まれていない。

注：lac乳糖オペロンを含むプラスミド（例えば、pET 28 aなど）は収量に大きな影響を与え、直接使用することはお勧めしません。

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2. テンプレート作成

無細胞タンパク質合成キットは、DNAまたはmRNAをテンプレートとして用いて組換えタンパク質を発現することができる。用いたDNAテンプレートはプラスミドであってもよく、PCR生成物であってもよく、phi 29を用いてRCAローリング増幅を行ったものであってもよい。

2.1プラスミド：遺伝子会社による合成、またはサブクローンにより無細胞反応に適したプラスミドを獲得し、カラム精製方式によりプラスミドを抽出する、

2.2 PCR生成物：プライマーを設計し、順方向プライマーはT 7プロモーターの上流で200 bp前後、逆方向プライマーは終止コドンの下流で200 bp前後（T 7 terminatorを含む）、テンプレートを増幅し、得られたDNA線形断片は精製せずに無細胞反応系に直接投入することができる。上下流200 bp塩基の役割は、DNA線形断片が内因性エキソヌクレアーゼによって分解されないように保護することである。

2.3 RCA製品：phi 29ポリメラーゼ、ランダム六プライマーを用いて転環増幅RCAを行い、得られたDNA生成物は直接無細胞反応系に用いることができる。

2.4 PCRとRCAはGolden GateおよびGibson Assemblyと併用することができ、DNAテンプレートの製造速度とフラックスを大幅に向上させることができる。

2.5高品質のプラスミド抽出キットを用いてプラスミド抽出を行い、RNase Aの導入を避けることを提案する。遺伝子合成会社から戻ってきたプラスミドはカラム精製方式の使用を強調しなければならず、そうしないと無細胞反応に直接使用することはできない。

3. 無細胞蛋白発現

3.1反応系の総量から必要なA液とB液（体積比1：2）を計算し、使用した試薬を氷に反応容器（例えば2 mlの円底遠心管）に添加し、混合した。操作過程は全過程で手袋、マスクを着用し、酵素源のないピペットを用いて頭と反応容器を吸引し、核酸酵素の導入を避ける必要がある。

無細胞反応系は以下の表を参照して混合調製することができる：

3.2反応系にテンプレートDNAを添加し、DNAテンプレートの添加最終濃度は5 ~ 10μg/mlを推奨し、DNAテンプレートの添加量を最適化することができる。

3.3反応容器を通常のロッカまたは恒温混和計に入れ、無細胞蛋白発現を行い、推奨反応温度は25 ~ 30℃である。温度を下げるとタンパク質の合成速度は低下するが、タンパク質の可溶性は増加する。一般的に8 h程度反応すれば最もdaの蛋白生産量に達することができ、一晩中16 h反応することもできる。反応温度が低下する場合、適切に反応時間を増加すべきである。

3.4無細胞タンパク質発現には十分な酸素が必要であり、2 mlの円底遠心管を反応容器として使用した場合、反応系は100μlを超えない。無細胞蛋白質反応は等比で増幅することができ、増幅された反応系はより大きな反応容器、例えばフラスコなどを使用する必要があり、同時にロッキングベッドの回転速度（200 rpm）を保証する。

4.検出

反応終了後、反応液（全蛋白質検出）または反応上清（可溶性蛋白質検出）を1μl程度採取し、SDS-PAGE蛋白質ゲル電気泳動検出目的蛋白質の発現を行った。

本キットには陽性対照として緑色蛍光蛋白質sf-GFPプラスミドがあり、肉眼で直接反応結果を観察することができる。sf−GFPの発現に成功すると、無細胞反応系は明らかな緑色を呈する。

sf-GFPを正確に定量する必要がある場合は、酵素スケールを用いて検出することができる（Ex/Em=485/528 nm）。