CHIP検出キット（磁性）

品番：CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

きおくじょうけん：4ºC保存

製品説明

CHIP検出キットは、免疫沈殿により目的のタンパク質と結合した染色質断片を沈殿させ、最後にPCRやSouthernなどの方法により沈殿した染色質断片を検出するためのキットである。通常、特定の転写因子またはヒストンなどのゲノムDNA結合タンパク質が、予想される特定のゲノムDNA配列と同じ複合体中にあるかどうかを検出するために使用される。ChIP検出により、体の（In Vivo）標的蛋白質と予想されるゲノムDNA断片が同じ複合体中にあるかどうかの結論を得ることができる。ChIPの検出結果は、この結合が細胞内で実際に発生していることを明らかにすることができる。

ほんChIP検出キットはCHIPプルダウンビーズとしてHA/DYKDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic beadsを採用し、積載量が高く結合力が強く、時間がかからず効率的である特徴がある。 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

操作手順（参考用）：

一、サンプル超音波処理条件の最適化：

1.適量の予冷PBS、および100 mM PMSFを準備する。SDS Lysis Bufferを適切な温度浴でSDSを十分に溶解させ、混合した。

2.細胞培養液の使用量は10 mlで、250 px細胞培養皿に細胞を培養した。目的のタンパク質とゲノムDNA結合が予想される時間に直接細胞培養液に適量のホルムアルデヒドを加え、最終濃度が1%になるまで軽く混合した。次いで、目的のタンパク質と対応するゲノムDNAを架橋するために、37ºCで10分間インキュベートした。例：250 px細胞培養皿に10 ml細胞培養液を添加する場合、270 ul 37%ホルムアルデヒドを添加する必要がある。できるだけ高品質で有効使用期限内のホルムアルデヒドを使用するように注意してください。細胞は150 px細胞シャーレに培養することもでき、関連溶液の使用量は割合に応じて調整する必要がある。

室温で5分間放置する。

4.細胞試料を有するシャーレを氷浴上に置く。ホルムアルデヒドとglycineを含む培養液を吸引し、できるだけ液体の残留がないようにした。

5.室温を5分間放置し、その間に100 mM PMSFから1 mMまで予冷PBSで希釈する、すなわち氷浴予冷用に調製された1 mM PMSF含有PBS。PMSF水性溶液は、水相中の半減期が約30 minである新鮮に調製しなければならない。

6.5-10 mlの予冷PBS（1 mM PMSFを含む）を添加し、細胞を洗浄し、液体を吸引し、できるだけ液体の残留がないように維持する。

7.さらに5-10 mlの予冷PBS（1 mM PMSFを含む）を加え、さらに細胞を洗浄し、液体を吸い上げ、できるだけ液体の残留がないように維持した。

8.予冷された1 mlのPBS（1 mM PMSFを含む）を加え、細胞を細胞スクレーパでスクレーパし、遠心管に集めた。細胞を計数し、1管あたり約100万細胞に分注した。

9.4ºC、800〜1000 gを1〜2分間遠心分離し、細胞を十分に沈殿させる。沈殿が不十分であることが見つかれば、遠心時間を適切に延長することができる。上澄みを吸い尽くし、液体の残留をできるだけ減らす。

10.1 mM PMSFを含むSDS Lysis Bufferの適量を調製する。前工程の100万細胞沈殿物を0.2 mlの1 mM PMSFを含むSDS Lysis Bufferで再懸濁した。

11.細胞を十分に分解するために氷浴上で10分間インキュベートした。

12.ゲノムDNAを切り取り、DNAの大部分を200〜1000 bpの大きさに切断するための超音波処理。大部分の断片を400〜800 bpに制御できればより好ましい。超音波中はサンプルを氷浴中で低温に保つことに注意してください。超音波処理の条件は通常10秒ごとに3 ~ 4回設定でき、電力が50 Wの場合は最大電力の30%に設定でき、2 mm超音波ヘッドを採用する。

異なる超音波処理機器の設置はあまり異なり、超音波条件を模索する際には、まず他の条件を固定し、毎回の超音波がどのくらいの時間で明らかな発熱を招かないかを確定してから、異なる超音波回数を模索することができる。適切な超音波回数が見つかるまでゲノムの大部分をDNAは200〜1000 bpの大きさに切断された。毎回の超音波体積と細胞使用量は固定しておくべきであることに注意しなければならない。そうしないと、比較的固定された超音波条件を後続の実験に使用することはできない。

注：超音波後ゲノムDNAの大きさを測定する際、アガロースゲル点染法（つまり核酸染料をloading bufferに添加する方式）またはゲル染色法を採用すると、電気泳動時にSDSがこのような染料と結合して異常なストリップを形成するため、ストリップは通常500-1000 bp程度であるため、超音波後のゲノムDNAの大きさの判断に一定の影響を与える。後染法を用いてストリップサイズの検出を行うことを提案し、この方法を用いて異常ストリップが出現せず、超音波後ゲノムDNAサイズの判断に影響せず、しかもストリップサイズはより正確である。

13.0.2 mlの超音波処理されたサンプルに8 ul 5 M NaClを添加し、混合した。65ºCを4時間加熱して、タンパク質とゲノムDNA間の架橋を除去した。

14.等体積のTrisバランスを加えるベンゼン分（ぶん），vortexは激しく混和し、その後4ºC、12000 g前後で5分間遠心分離した。別の遠心管に吸い上げる。

15.等体積クロロホルムを加え、vortexを激しく混合し、その後4ºC、12000 g前後を5分間遠心分離した。別の遠心管に吸い上げる。

注：上記ステップ14及び15のフェノールクロロホルム抽出は、DNA精製キットを用いて行うことができる。

二、染色質免疫沈殿：

1.試料の超音波処理条件を最適化した後、測定すべき試料に対して試料の超音波処理条件の最適化中1-11の手順を実行し、手順を参照してください。12超音波処理を行う。

2.超音波処理されたサンプルについて、4ºC、12000-14000 gで5分間遠心分離した。上澄み（約0.2 ml）〜2 mlの遠心管を取り出し、氷浴に入れた。

3.1 mM PMSFを含むChIP Dilution Bufferを適量配合する。

4.後続の検出のためにInputとして20 ulサンプルを取り出した。とる20 ul HA/DYKDDK/Myc/GFPナノ抗体ビーズ追加PBSまたはTBST溶液を500 ulまで吹き付け洗浄し、磁気棚に置いてピペットで丁寧に洗浄し、2〜3回繰り返し洗浄する（非特異性をより良くするために1〜5%BSAまたはスキムミルクでBeadsを1時間前処理してもよい）。

5.洗浄または密封したもの20 ul HA/DYKDDK/Myc/GFPナノ抗体ビーズステップに参加する3残りのサンプルでは、同時に無細胞サンプルの溶液を空白対照として使用し、beadsサンプルを陰性対照として使用しないか、または無関係抗体を陰性対照として使用した。

6.以上のサンプルを含む遠心管を磁力棚に10 s置く。上澄みを非常に注意して除去し、沈殿物に触れないようにしてください。その後、沈殿物を次の溶液で順次洗浄し、毎回の洗浄液の使用量は1 mlで、毎回4ºCでゆっくり回転したり、3-5 min揺動したりして洗浄し、その後磁力棚に10 s置いた。上澄み液を慎重に除去し、沈殿物に触れないように注意してください。

（a）Low Salt Immune Complex Wash Bufferを1回洗浄する。

（b）High Salt Immune Complex Wash Bufferを1回洗浄する。

（c）LiCl Immune Complex Wash Buffer洗浄1回。

（d）TE Buffer洗浄を2回行った。

注：上記の洗浄工程をすべて完了した後に得られた沈殿物は、PCR増幅目的遺伝子配列またはSouthernを用いた目的遺伝子配列の検出、またはWestern検出などに用いることができる。

三、PCR増幅目的遺伝子配列（例えばChIP生成物が目的遺伝子配列を検出するために使用される）：

1.新鮮配合適量Elution buffer（1%SDS、0.1 M NaHCO 3）。

免疫沈殿工程第7ステップ後、すなわちすべての洗浄ステップが完了したら、250ul Elution buffer。Vortexは混和し、室温で回転したり揺動したりして3〜5分間溶出を続けた。

3.磁気ホルダ上に置いて10秒間分離し、上清を新しい遠心管に移した。沈殿物に250 ul Elution bufferを加えた。Vortexは混和し、室温で回転したり揺動したりして3〜5分間溶出を続けた。

前のステップであるステップ3で得られた上清とマージします。合計約500 ulの上清。

5.500 ul上清に20 ul 5 M NaClを加え、よく混ぜる。65ºCを4時間加熱して、タンパク質とゲノムDNA間の架橋を除去した。ステップ2 Dで得られたInputとしての20 ulサンプルに対して、1 ul 5 M NaClを添加し、均質化し、65ºCで4時間加熱し、同様に蛋白とゲノムDNA間の架橋を除去した。この手順が完了したら、次の手順に進むか、最初に-20ºCを凍結保存し、翌日に次の手順に進むことができます。

注1：この時点でのサンプルはすでに使用可能PCR，PCR検出のためのテンプレートとして1、2、5、または10 ulのサンプルを使用することが試みられる。このときのPCRの効果は、沈殿される可能性のあるDNAの量、およびPCR増幅システム全体が目的の遺伝子を増幅しやすいかどうかに関係している。

注2：通常、後続精製を行ってから行うことを推奨するPCR検査、Inputは一般的に後続の精製工程を行う必要はない。

6.約520 ulのサンプルに10 ul 0.5 M EDTA、20 ul 1 M Tris pH 6.5と1 ul 20 mg/mlプロテアーゼKを添加した。混合後45ºCで60分間インキュベートした。

7.等体積Trisバランスを加えるベンゼン分（ぶん），vortexは激しく混和し、その後4ºC、12000 g前後で5分間遠心分離した。別の遠心管に吸い上げる。

8.等体積クロロホルムを加え、vortexを激しく混合し、その後4ºC、12000 g前後を5分間遠心分離した。別の遠心管に吸い上げる。

混和後−70ºC沈殿は1時間以上、または−20ºC沈殿は8時間以上であった。

10.4ºC、12000-14000 gは10分間遠心分離し、大部分の上清を慎重に吸引し、沈殿物に触れないように注意する。

11.約1 mlの70%エタノールを加えて洗浄沈殿した。4ºC、12000-14000 g遠心分離10 min、大部分の上清を慎重に吸引し、沈殿物に接触しないでください。

12.4ºC、12000-14000 gは1 min遠心分離し、残留液体を慎重に吸引除去する。

13.目的の遺伝子のPCR検査のために少量のTEまたは水重懸濁DNAを用いて沈殿させる。PCRに用いられるプライマーは2つのグループを設計することが好ましく、Inputをテンプレートとして予め対応するPCR条件を模索し、効果の高いプライマーのセットを最終的なPCR検査に用いることができる。少数の場合、PCRストリップが弱すぎる場合、nested PCR技術を用いて、2回の増幅を行うことができる。

注：ステップ

四、WesternはChIP生成物を検出する（もしChIP生成物がWestern検出に使用される場合）：

1.手順に続くせんしょくしつ免疫沈殿第8ステップで、すべての洗浄工程が完了したら、25 ul SDS-PAGEタンパク質上様緩衝液（1 X）を加えた。SDS−PAGEタンパク質上様緩衝液（1 X）は、SDS−PAGEタンパク質上様緩衝液（5 X）を水で希釈して調製することができる。熱湯浴を10分間煮沸する。

注意事項：

1、ChIP用の一抗、37%ホルムアルデヒドを自己準備する必要があり、PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)，プロテアーゼK、GlycogenまたはtRNA、Trisバランスベンゼン分（ぶん）、クロロホルム、95%エタノール、70%エタノール、3 M NaAc（pH 5.2）及び磁気棚、細胞スクレーパー又は細胞スクレーパー。

2、超音波サンプル処理器（sonicator）を持参する必要があり、超音波粉砕機または超音波細胞粉砕機とも呼ばれる。

3、ホルムアルデヒドを使用する場合は、通風ケースで操作してください。

4、本製品は専門家の科学研究用に限られ、臨床診断や治療に使用してはならず、食品や薬品に使用してはならず、一般住宅に保管してはならない。

6、あなたの安全と健康のために、実験服を着て使い捨て手袋をして操作してください。