新規基準対応－NY/T 4630-2025牛乳及びその製品中のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの測定

私たちについて

Thermo Fisher Scientific consumables for chromatography

メール
zoe.wang2@thermofisher.com
電話
18516780105
住所
xinjinqiao道路、No.27、建物6

日付：2025-05-27読み：0

はじめに

生牛乳には、細菌、ウイルスの侵入に抵抗し、免疫力を増強し、組織修復と成長発育を促進するなど、多種の天然活性蛋白質が豊富に含まれており、これらの天然活性蛋白質は細菌、ウイルスの侵入に抵抗し、免疫力を増強し、組織修復と成長発育を促進するなどの面で重要な役割を果たしている。その中のα-ラクトアルブミンは抗がん、抗菌と抗ウイルス作用を持ち、免疫機能を調節し、乳糖合成と乳分泌を促進する、β−ラクトグロブリンはコレステロール降下、抗酸化と抗ウイルス活性を有し、脂溶性ビタミンの消化吸収を促進する。異なる熱処理方式（低温殺菌、超高温（UHT）滅菌、蒸発濃縮及び噴霧乾燥など）により、乳製品中のα−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンに異なる程度の変性失活が発生し、それによりその栄養価値及び市場価格に影響を与える。

サイマー飛新行標対応方案のハイライト

1.本試験はNY/T 4630-2025及び関連団体基準と企業基準を参考にして、低温殺菌乳、超高温滅菌乳と乳幼児用調合粉ミルク中のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの含有量を測定した。NY/T 4630-2025は2025年5月1日に正式に実施される。

2. 本試験では、2.6μm粒径の中実核粒子Accucore 150 C 4カラムを用いて、より低い流速（0.8 mL/分）、より小さな注入体積（10μL）とより高いサンプリング周波数（10 Hz）により、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンのピーク及び分離度はいずれも標準に起因する。

3. 良好なピーク形状と分離度を得るために、試験はサンプルの前処理と液体クロマトグラフィー条件を適切に最適化し、カラム温度60℃、流速0.8 mL/minの条件下で、0.1%トリフルオロ酢酸水-0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリルを流動相として勾配溶出を行い、システムの最大圧力値は超えない110 バー。

4. 試験結果：α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンクロマトグラフィーのピークは良好で、カラム効果が優れ、分離度が優れ、その中でα−ラクトアルブミン主ピークと近傍干渉ピークの分離度は標準スペクトルより顕著に優れている。α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン混合標準品溶液（100μg/mL）、α-ラクトアルブミン保持時間は21.900 min、非対称因子0.98、理論段数321137、β−ラクトグロブリンBの保持時間は24.747 min、非対称因子1.01、理論段数352451、β−ラクトグロブリンAの保持時間は25.467 min、非対称因子は1.00、理論段数は373359、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンBの分離度は17.77、β−ラクトグロブリンBとβ−ラクトグロブリンAの分離度は4.33、4回連続注入し、保持時間とピーク面積のRSDはいずれも0.3%未満で、方法の再現性が良い、α-ラクトアルブミン標準品溶液の線形範囲0.00 ~ 200μg/mL、線形相関係数r²≥0.9997、β-ラクトグロブリン標準品溶液の線形範囲0.00-200μg/mL、線形相関係数r²≥0.9991、線形良好。

5. 逆相液体クロマトグラフィーによる乳製品中のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの含有量測定試験において、Accucore 150 C4 のカラムにVanquish Core高効率液体クロマトグラフィーシステムを配合し、良好な再現性と優れた安定性を示し、方法の検出限界と定量限界はすべて標準要求を満たし、乳製品企業及び食品検査実験室の参考に供することができる。

6.関連文献を参照して、ゲル浸透クロマトグラフィーによる乳製品中のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの含有量を測定する試験において、2本を直列に用いたMAbPac SEC-1（300 Å、5 μm、7.8×300 mm）体積排除クロマトグラフィーカラムは、6 M塩酸グアニジンを流動相として等度溶出し、280 nmでα−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンを効果的に分離することができる。

すべてを下にスライド

ニューヨーク/T 4630-2025

サイマー飛完全応用ソリューション

サンプル前処理

1.1液体試料：低温乳（生牛乳、低温殺菌乳）/常温乳（超高温（UHT）滅菌乳）

試料5 g（正確には0.1 mg）を50 mLの目盛り付き回転蓋付き遠心管に秤量し、適量の水渦を加えて30 s混合し、適量の酢酸でpHを4.60±0.05に調整した後、水で25.0 mLに定容し、渦を1 min混合し、30 min以上静置し、12000 rpm 4℃で15 min遠心分離した。上清液（適宜超純水で希釈することができる）を取り、0.2μm親水性PTFE微孔ろ過膜（P/N：42213-NPL）を通過し、ろ過液は機械試験を待つ。

1.2固体試料：粉ミルク（乳幼児用調製粉ミルク）

試料2 g（正確には0.1 mg）を50 mLの目盛り付きジャイロキャップ付き遠心管に秤量し、適量の水渦を加えて1分間混合して十分に溶解させ（必要に応じて温水浴化できる）、適量の酢酸でpHを4.60±0.05に調節した後、水で25.0 mLに定容し、渦を1分間混合し、30 min以上静置し、12000 rpm 4℃で15分間遠心分離した。上清液（適宜超純水で希釈することができる）を取り、0.2μm親水性PTFE微孔ろ過膜（P/N：42213-NPL）を通過し、ろ過液は機械試験を待つ。

すべてを下にスライド

計器配置及びクロマトグラフィー条件

Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高効率液体クロマトグラフィーシステム、構成：ポンプQuaternary Pump C（VC-P 20-A）、自動サンプラSplit Sampler CT（VC-A 12-A）、カラム温度箱Column Compartment C（VC-C 10-A）、検出器Diode Array Detector CG（VC-D 11-A）、データ処理Chromeleon™ 7.3

カラム：Accucore 150 C 4、2.6μm、4.6×150 mm（P/N：16526-154630）

移動相：A：0.1%トリフルオロ酢酸水B：0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル

流速：0.8mL/分

勾配溶出手順：

注入量：10µL

カラム温度：60℃

検出器：DAD、収集波長：210 nm、収集周波数：10Hz、スペクトル収集：190-400 nm

すべてを下にスライド

スペクトル及びデータ

3.1α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリン混合標準品溶液の分離スペクトル及びデータ

図1α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリン混合標準品溶液の分離スペクトル及びデータ（100μg/mL）（クリックしてグラフを見る）

図1に示すように、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンクロマトグラフィーはピーク形状が良く、カラム効果が優れ、分離度が標準より優れている。α−ラクトアルブミンの保持時間は21.900 min、非対称因子は0.98、理論段数は321137、β−ラクトグロブリンBの保持時間は24.747 min、非対称因子1.01、理論段数352451、β−ラクトグロブリンAの保持時間は25.467 min、非対称因子は1.00、理論段数は373359であった。α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンBの分離度は17.77、β−ラクトグロブリンBとβ−ラクトグロブリンAの分離度は4.33であった。

3.2α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの単一標準品溶液の定位重畳スペクトル

図2α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン単一標準品溶液の定位重畳スペクトル（クリックして大図を見る）

α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの単標位置決めクロマトグラフィーとスペクトル図、図2に示すように、α-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリンBとβ-ラクトグロブリンAはいずれも200 nmと279 nmで特徴的に吸収されている。

3.3α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリン混合標準品溶液の連続注入重ね合わせスペクトル

図3α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン混合標準品溶液の連続注入重ね合わせスペクトル（100μg/mL、n=4）（クリックして大図を見る）

α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン混合標準品溶液（100μg/mL）を4回連続注入し、保存時間とピーク面積のRSDはいずれも0.3%未満で、方法の再現性が良く、分離スペクトル及びデータの詳細は図3を参照。

3.4α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン標準品溶液の較正曲線の重ね合わせスペクトル

図4α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン標準品溶液の較正曲線の重ね合わせスペクトル（0.00/40.0/80.0/120/160/200μg/mL）（クリックして大図を見る）

生牛乳、低温殺菌乳中のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの含有量は通常高いため、T/TDSTIA 002-2021とT/TDSTIA 007-2019の2つの団体標準が推薦する線形範囲を選択した。図4に示すように、α-ラクトアルブミン標準品溶液の線形範囲は0.00-200μg/mL、線形相関係数r²≥0.9997、β-ラクトグロブリン標準品溶液の線形範囲0.00-200μg/mL、線形相関係数r²≥0.9991、線形良好。ここで、β−ラクトグロブリンBとβ−ラクトグロブリンAは化合物群を用いて定量される。

3.5α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン標準品溶液（40.0μg/mL）と空白溶液の重畳スペクトル

図5α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン標準品溶液（40.0μg/mL）と空白溶液の重畳スペクトル（クリックして大図を見る）

注入体積が10 uLの場合、図5に示すように、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリン（40.0μg/mL）のピーク高さをSとして、22.5−24.0 min基質騒音の平均値をNとして選択し、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンBとβ−ラクトグロブリンAの信号対雑音比S／Nはそれぞれ523.3、139.9、133.6であった。そのため、配合注入体積の最適化、α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン測定方法の感度もNY/T 4630-2025中の1.00μg/mLの要求を満たすことができる。

3.6α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリン混合標準品溶液と低温殺菌乳試料溶液の重畳スペクトル

図6α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン混合標準品溶液と低温殺菌乳試料溶液の重畳スペクトル（クリックして大図を見る）

乳清タンパク質のほか、牛乳にはカゼインやその他のタンパク質が多く含まれており、α-乳白質やβ-ラクトグロブリンの測定に干渉する可能性があります。低温殺菌乳サンプルはpH調整、高速遠心分離などの前処理操作を経た後、未変性のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンは上清液中に保持され、その分離保持のピーク型は比較的良く、ベースラインは安定で、ピークが出る時に干渉がなく、図6に示すように。外部標準法を用いて定量したところ、低温殺菌乳サンプル中のα-ラクトアルブミンは1033.6 mg/kgとβ-ラクトグロブリン含有量は2949.0 mg/kgであり、ラベル値とほぼ一致した。

3.7低温乳、超高温滅菌乳（常温乳）及び乳幼児用調製粉ミルクサンプル溶液の分離スペクトル及びデータ

図7低温乳試料溶液分離スペクトル及びデータ

（クリックしてグラフを見る）

図8超高温滅菌乳（常温乳）試料溶液分離スペクトル及びデータ

（クリックしてグラフを見る）

図9乳幼児用調製粉ミルクサンプル溶液分離スペクトル及びデータ

（クリックしてグラフを見る）

スライド表示詳細

α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンは温度に敏感であり、高温はその化学構造と生物活性を破壊する。図7-9に示すように、低温乳中のα-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンの目標ピーク付近には明らかな妨害ピークが存在せず、正確な確定性と定量ができ、生牛乳、低温殺菌乳などのサンプルはNY/T 4630-2025第一法に適用できる、一方、超高温滅菌乳（常温乳）と乳幼児用調製粉ミルクの中のβ-ラクトグロブリンの目標ピーク付近に明らかな妨害ピークが存在し、定性と定量結果に深刻な影響を与えることができ、α-ラクトグロブリンの影響は比較的に小さく、超高温滅菌乳、乳幼児用調製粉ミルクなどのサンプルはNY/T 4630-2025第1法に適用されず、第2法を採用することを提案した。

3.8α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリン標準溶液のゲル浸透クロマトグラフィー（第2法）

図10α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン標準溶液（500 mg/L）ゲル浸透クロマトグラフィー（クリックして大図を見る）

杜茹芸先生が「中国乳品工業」誌に発表した文章「体積排除クロマトグラフィーによる牛乳、粉ミルク、乳清粉中のα-乳白質の含有量の測定」（2022年）を参考にして、2本のMAbPac SEC-1（300Å、5μm、7.8×300 mm）体積排除クロマトグラフィーカラムを直列に使用し、6 M塩酸グアニジンを流動相として等度溶出し、280 nmでα-乳白質とβ-ラクトグロブリン（図10に示すように）を効果的に分離し、そして60ロットの牛乳、粉ミルク及び乳清粉をテストし、方法を検証した適用性と安定性、相関スペクトル図及びデータの詳細は原文を参照。

本文で選択したMAbPac SEC-1カラムの規格は7.8×300mm，推奨流速は0.5 mL/minであり、分離度を確保しながら溶媒の節約を実現し、選択可能4.0×300mm仕様カラムで、流速は0.2 mL/min（適宜調整可能）を推奨します。

NY/T 4630-2025関連クロマトグラフィー消耗品の推奨

4.1第一法逆相液体クロマトグラフィー分析カラム及び保護カラム
Accucore 150 C4、2.6 μm、4.6×150 mm	（番号：16526-154630）
Accucore 150 C 4保護カラムコア、2.6μm、4.0×10 mm、4 pk	（番号：16526-014005）
Uniguard Direct Protect Body Caps	（P/N: 850-00）

4.2第二法ゲル浸透クロマトグラフィー分析カラム及び保護カラム

流速：0.5mL/分
保护柱：MAbPac SEC-1、5 μm、300 Å、4.0×50 mm	（番号：074697）
分析柱：MAbPac SEC-1、5 μm、300 Å、7.8×300 mm	（番号：088460）
分析柱：MAbPac SEC-1、5 μm、300 Å、7.8×300 mm	（番号：088460）

流速：0.2mL/分
保护柱：MAbPac SEC-1、5 μm、300 Å、4.0×50 mm	（番号：074697）
分析柱：MAbPac SEC-1、5 μm、300 Å、4.0×300 mm	（番号：074696）
分析柱：MAbPac SEC-1、5 μm、300 Å、4.0×300 mm	（番号：074696）

4.3サンプル前処理
Titan 3親水性PTFEニードルフィルター、17 mm、0.2μm、200/pk	（番号：42213-NPL）

すべてを下にスライド

参考文献

［1］NY/T 4630-2025牛乳及びその製品中のα-ラクトアルブミン及びβ-ラクトグロブリンの測定高効率液体クロマトグラフィー法

［2］T／TDSTIA 026−2022乳幼児用調製粉乳中のα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンの測定−ゲル浸透クロマトグラフィー

［3］T/TDSTIA 002-2021乳及び乳製品中のα-ラクトアルブミンの測定高効率液体クロマトグラフィー法

［4］T／CSIQ 77001−2020乳製品中のα−ラクトアルブミン含有量の測定高効率液体クロマトグラフィー法

［5］T/TDSTIA 007−2019乳製品中のβ−ラクトグロブリンの測定液クロマトグラフィー法

［6］T／SHNX 001−2025生乳中のラクトフェリン、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンの測定液クロマトグラフィー−タンデム質量分析法

[7]杜茹芸、王亮、林毅侃.体積排除クロマトグラフィーによる牛乳、粉乳、乳清粉中のα-ラクトアルブミンの含有量の測定[J]。中国乳製品工業、2022、50（04）：46-51.

前の記事：新国標準対応-GB 5009.299-2024食品中のラクトフェリンの測定

次の章：技術革新による品質向上と効率化｜1つの移動相条件による蛋白質、mRNA及びAAVのポリマー分析の完了