-
メール
zoe.wang2@thermofisher.com
-
電話
18516780105
-
住所
xinjinqiao道路、No.27、建物6
Thermo Fisher Scientific consumables for chromatography
新国標準対応-GB 5009.299-2024食品中のラクトフェリンの測定
日付：2025-05-27読み：0
生牛乳には、細菌、ウイルスの侵入に抵抗し、免疫力を増強し、組織修復と成長発育を促進するなど、多種の天然活性蛋白質が豊富に含まれており、これらの天然活性蛋白質は細菌、ウイルスの侵入に抵抗し、免疫力を増強し、組織修復と成長発育を促進するなどの面で重要な役割を果たしている。その中でラクトフェリンは生体鉄代謝に参与し、体内の鉄元素の吸収と輸送を促進し、抗菌、抗炎症、抗酸化、抗腫瘍と免疫力を増強する機能を有する。異なる熱処理方式（低温殺菌、超高温（UHT）滅菌、蒸発濃縮及び噴霧乾燥など）により、乳製品中のラクトフェリンに異なる程度の変性失活が発生し、それによりその栄養価値及び市場価格に影響を与える。
サイマー飛新国標対応方案のハイライト
1. 本試験はGB 5009.299-2024、NY/T 4439-2023及び関連団体標準と企業標準を参考にして、低温殺菌乳、超高温滅菌乳と乳幼児用調合粉ミルク中のラクトフェリンの含有量を測定した。
2. 良好なピーク形状と分離度を得るために、試験はサンプルの前処理と液体クロマトグラフィー条件を適切に最適化し、カラム温度30℃、流速1.0 mL/min条件下で、0.1%トリフルオロ酢酸水-0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル流動相として勾配溶出を行い、システムの最大圧力値は106 barを超えない。
3. 試験結果：ラクトフェリン標準品溶液（50.0μg/mL）クロマトグラフィーピーク非対称因子1.00、ピーク形状良好、理論段数30549、カラム効果優れ、連続3回のサンプリングで、保持時間とピーク面積のRSDはいずれも1%未満で、方法の再現性が良い、線形低点（1.00μg/mL）信号対雑音比は8.2であり、方法の感度は比較的に高い、線形範囲1.00-200μg/mL、線形相関係数r2≥0.9998、線形良好。
4. 逆相液体クロマトグラフィーによる乳製品中のラクトフェリン含有量の測定試験において、BioBasic 4クロマトグラフィーカラム（孔径300Å）はVanquish Core高効率液体クロマトグラフィーシステムを配合し、良好な再現性と優れた安定性を示し、方法の検出限界と定量限界はいずれも基準要求を満たし、乳製品企業及び食品検査実験室の参考に供することができる。
すべてを下にスライド
GB 5009.299-2024
サイマー飛完全応用ソリューション
サンプル前処理
1.1試料抽出
1.1.1液体試料：低温乳（生牛乳、低温殺菌乳）/常温乳（超高温（UHT）滅菌乳）
試料5 g（正確には0.1 mg）を50 mLの目盛り付きジャイロキャップ付き遠心管に秤量し、リン酸塩緩衝液IIで25.0 mLに定容し、渦振動で3 min、12000 rpm 4℃で15 min遠心した。室温で静置し、上層浮脂を除去し、上澄み液を取って浄化する。
1.1.2固体試料：粉ミルク（乳幼児用調製粉ミルク）
試料2 g（正確には0.1 mg）を50 mLの目盛り付き回転蓋付き遠心管に秤量し、適量のリン酸塩緩衝液IIを加えて温度振動溶解し、リン酸塩緩衝液IIを50.0 mLに定容し、渦振動を3 min抽出し、30 min以上静置し、12000 rpm 4℃で15 min遠心分離した。室温で静置し、上層浮脂を除去し、上澄み液を取って浄化する。
すべてを下にスライド
1.2試料浄化
1.2.1活性化：HyperSepヘパリン親和柱（P/N：60105-110-B）下端Luer継手を固相抽出装置に接続し、上端をアダプター（P/N：60104-259）を通じて10 mLシリンジ空筒に直列接続し、2×5 mLリン酸塩緩衝液IIを加えてヘパリン親和性を活性化し、滴下速度2 d/3 sを制御する、
1.2.2サンプルアップ：活性化工程の液面が小柱スクリーンに接近する時、上記サンプル10.0 mLを正確に移してシリンジ空筒（P/N：S 7510-10）に入れ、滴速2 d/3 sを制御し、流出液を捨てる、
1.2.3リンス：上述の工程で液面が小柱篩板に近づく時、2×5 mLリン酸塩緩衝液IIを加えて小柱をリンスし、流出液を捨て、アダプターと注射器空筒を除去し、負圧で小柱を2 min吸引乾燥する、
1.2.4溶出：2×2.5 mLリン酸塩緩衝液Iを加えて溶出し、すべての溶出液を収集し、リン酸塩緩衝液Iを用いて5.00 mLに定容し、0.2μm親水性PTFE針式フィルター（P/N：42213-NPL）を通過し、濾液は機械試験を待つ。
すべてを下にスライド
計器配置及びクロマトグラフィー条件
Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高効率液体クロマトグラフィーシステム、構成：ポンプQuaternary Pump C（VC-P 20-A）、自動サンプラSplit Sampler CT（VC-A 12-A）、カラム温度箱Column Compartment C（VC-C 10-A）、検出器Diode Array Detector CG（VC-D 11-A）、データ処理Chromeleon™ 7.3
カラム：BioBasic 4、5μm、4.6×250 mm（P/N：72305-254630）
移動相：A：0.1%トリフルオロ酢酸水B：0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル
流速：1.0 mL/min
勾配溶出手順：
注入量：50µL
カラム温度：30℃
検出器：DAD、収集波長：280 nm、収集周波数：5 Hz、スペクトル収集：190-400 nm
すべてを下にスライド
スペクトル及びデータ
3.1ラクトフェリン標準品溶液の分離スペクトル及びデータ
図1ラクトフェリン標準品溶液の分離スペクトル及びデータ（50.0μg/mL）（クリックしてグラフを見る）
図1に示すように、ラクトフェリン標準品溶液（50.0μg/mL）の保持時間は12.137 minであり、クロマトグラフィーピーク形状が良好で、非対称因子が1.00であり、カラム効果が優れ、理論段数30549である。ラクトフェリンは280 nmに特徴的な吸収ピークがある。
3.2ラクトフェリン標準品溶液の連続注入重ね合わせスペクトル
図2ラクトフェリン標準品溶液連続注入重ね合わせスペクトル（50.0μg/mL、n=3）（クリックして大図を見る）
ラクトフェリン標準品溶液（50.0μg/mL）を3回連続で注入し、保存時間とピーク面積のRSDはいずれも1%未満で、方法の再現性が良く、分離スペクトル及びデータの詳細は図2を参照。
3.3ラクトフェリン標準品溶液の校正曲線の重ね合わせスペクトル図
図3ラクトフェリン標準品溶液較正曲線重ね合わせスペクトル（1.00/5.00/10.0/50.0/100/200μg/mL）（クリックして大図を見る）
図3に示すように、ラクトフェリン標準品溶液の線形範囲は1.00-200μg/mL、線形相関係数r2≥0.9998、線形良好。
3.4ラクトフェリン標準品溶液の線形最低点と空白溶液の重畳スペクトル
図4ラクトフェリン標準品溶液の線形最低点（1.00μg/mL）と空白溶液の重畳スペクトル（クリックして大図を見る）
注入体積が50 uLの場合、ラクトフェリン（1.00μg/mL）のピーク高をSとし、10.5-11.5 min基質騒音の平均値をNとし、線形低点信号対雑音比S/N=8.2を選択し、図4に示すように、ラクトフェリン測定方法の感度は比較的に高い。
3.5 0.1%トリフルオロ酢酸水−アセトニトリル移動相系におけるラクトフェリンの標準品溶液のピーク及び応答
図5：0.1%トリフルオロ酢酸水−アセトニトリル移動相系におけるラクトフェリンの標準品溶液重畳スペクトル（クリックして大図を見る）
図5に示すように、移動相Bが純アセトニトリルの場合、ラクトフェリンのピーク形状に深刻な尾引きが発生し、線形最低点（1.00μg/mL）の応答が悪く、自動積分ができず、方法の検出限界は標準要求を満たすことができない。ラクトフェリン業界標準NY/T 4439-2023と団体標準T/TDSTIA 006-2019で推薦されたクロマトグラフィー条件を総合して、本試験は最終的に0.1%トリフルオロ酢酸水-0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリルを流動相として勾配溶出を行い、しかもシステムの最大圧力値は106 barを超えない。
3.6低温乳（低温乳）、超高温滅菌乳（常温乳）及び乳幼児用調製粉ミルク試料溶液分離スペクトル
スライド表示詳細
ラクトフェリンは温度に非常に敏感であり、高温はその化学構造と生物活性を破壊し、ヘパリン親和柱を効果的に富化させることができない。図6-8に示すように、低温乳中のラクトフェリン含有量は13.4 mg/kg、一方、超高温滅菌乳（常温乳）と乳幼児用調製粉ミルク中のラクトフェリンはいずれも検出されなかった。
GB 5009.299-2024関連クロマトグラフィー消耗品推奨
分析カラム及び保護カラム | |
バイオベーシック 4,5 μm,4.6×250 mm | （番号：72305-254630） |
BioBasic保護カラムコア、5μm、4.0×10 mm、4 pk | （番号：72305-014001） |
Uniguard Direct Protect Body Caps | （P/N: 850-00） |
サンプル前処理 | |
HyperSepヘパリン親和柱、3 mg、10/pk | （P/N: 60105-110-B） |
HyperSepガラス室真空固相抽出装置、16ビット | （番号：60104-232） |
アダプター、1 mL、3 mL、6 mL SPE小柱アダプター、15/pk | （番号：60104-259） |
National Target全プラスチック使い捨て注射器、Luer-Slip, 10 mL, 100/pk | （商品番号：S7510-10） |
Titan 3親水性PTFEニードルフィルター、17 mm、0.2μm、200/pk | （番号：42213-NPL） |
すべてを下にスライド
参考文献
[1]GB 5009.299-2024食品安全国家標準食品におけるラクトフェリンの測定
（2）NY/T 4439-2023乳製品中のラクトフェリンの測定高効率液体クロマトグラフィー法
［3］T/TDSTIA 006-2019乳製品及び乳製品中のラクトフェリンの測定液クロマトグラフィー
［4］T／CCAA 70−2023牛乳系乳児用調製粉ミルク中のラクトフェリン含有量の測定液クロマトグラフィー−タンデム質量分析法