中国科学院上海薬物研究所はこのほど、国際 薬学 ジャーナル上に「ナノ材料の大きさと濃度の重要なパラメータを標準化したナノ粒子追跡分析」と題する文章を発表した。本研究では、著者らはサンプル構成、サンプル濃度、機器設定パラメータ、カメラ設定パラメータ、液体流速がNTA（NanoSight NS 300）の測定精度に与える影響を系統的に評価した。研究の過程で、彼らは同時に粒子粒径特性化の金基準、透過電子顕微鏡と抵抗パルスに基づくインダクタンス（RPS）原理のナノコルターナノクルト粒度分析器は直交実験を行い、粒子の粒径及び濃度測定に対するNTAの精度を交差検証した。

異なる粒子濃度における測定結果の精度の比較

図1のNTA測定結果に対するサンプル濃度の影響。

著者らは異なる大きさのポリスチレン（PS）とシリカ（SiO₂）標準粒子、異なる粒子濃度で測定し、異なる濃度での平均寸法と濃度偏差を比較した。その結果、粒子濃度が10⁸-10⁹ particles/mL間の場合、測定結果は最も正確で、線形傾向が最も良い。このとき対応視野内の粒子数は10−100と400−6500個であった。

異なる露光度が測定結果に与える影響の比較

図2. NTA測定結果に対する露出度の影響

DLSとは異なり、NTAはカメラを通じて粒子のリアルタイムのブラウン運動を追跡して粒子粒径計算を行った。したがってカメラ設定パラメータを最適化することで大幅に向上NTAが測定した粒径と濃度の精度。著者らは混合された異なるサイズのPS粒子を用いて、異なる露光度（camera level）の下で特徴づけた。露出度は、カメラが粒子の動きに敏感であることを示すパラメータである。露出度を調節することで、NTAの撮影結果に影響を与えることができます。その結果、露光度が6-9の場合、100 nmのPS粒子は観測できないが、200 nmのPS粒子ははっきりと見え、露光度が10-14の場合、100 nmのPS粒子ははっきりと観測できるが、200 nmのPS粒子は露光しすぎて結果に影響を与えることが分かった。その後、著者らはさらに露光度を評価し、100 nm、120 nm、150 nm、170 nm及び200 nmのPS粒子の粒径ピーク及び分布を特徴づけた。その結果、露光度の変化はPS粒子の粒径ピークに顕著な影響を与えなかったが、露光度の上昇に伴い、各グループのPS粒子の粒径平均値は上昇した。そのため著者は具体的な異なる大きさの粒子は露光度と共に粒径の測定結果に影響を与える。サンプル分散度が大きい場合、NTAカメラでは、すべての粒子を撮影できるように適切な露出度を見つけることが難しい。関連レポートを作成する際には、データの透明性を保証するためにNTAの露出度などの設定パラメータを一括して提出する必要があります。

異なるポンプ速度が測定結果に与える影響の比較

以前の研究では、溶液粘度が影響するNTA測定結果の精度しかし、ポンプ速度が測定結果にどのような影響を与えるかは未知であるため、著者らは異なる大きさのPS粒子を使用し、異なるポンプ速度で測定を行い、異なる速度での平均寸法と濃度偏差を比較した。その結果、より小さい場合200 nmの粒子、ポンプ速度50 AU（任意単位（arbitrary unit）内では比較的正確な結果が得られるが、より大きな粒子では正確性を保証するためにより低いポンプ速度が必要である。

図4. NTA、DLS、RPSによる多分散サンプルの測定影響

その後、これらの結果に基づいて、著者らはこの標準的な動作フローに従って、多分散サンプルに対するNTAの特徴づけ能力を評価した。著者らは1：1と10：1（濃度比）の100 nmと150 nm PS粒子混合物を調製し、異なる露光度に基づいて、NTAは7-10の範囲で2つのサンプルに対して2つの粒径ピーク位置を順調に測定することができる。その後、著者らはさらに1：1：1の100 nm、150 nmと200 nm及び1：1：1：1の100 nm、150 nm、170 nmと200 nmの3混合と4混合サンプルを調製した結果、NTAは測定を完了できず、1つの広いピークしか得られなかった。その後、著者らはさらにDLSとRPSを用いて上記4つのサンプルを分析し、DLSは、上記4つのサンプルのいずれについても正確なピークビットを測定することができず、1つの単一ピークしか得ることができないが、RPS理論に基づくNanoCoulter単粒子検出手段により、混合物の粒子径を測定し、正確なピーク位置を得ることに成功した続いて著者らはさらにRPSの粒径測定効果を検証し、濃度比が1：1：1：1の80 nm、120 nm、160 nmと200 nmの混合物を調製した。測定結果再確認RPSは順調に混合物を対応するピークを測定することができ、異なるサンプルピーク間の区別が明らかで、分解能が良好である。この4分布サンプルは、実際のサンプルをよりリアルに表すことができます。

最後に、著者らは2種類の外分泌体（それぞれHEK 293細胞と乾姜由来）を選択し、それぞれNTA、DLSとRPS技術を用いて粒径分析を行った。その結果、粒径分析において、NTAで得られたデータはTEMと類似しているが、DLS粒径値は大きく、RPSで得られた粒径結果は小さいことが分かった。濃度の面では、RPSはより正確な定量分析能力を示し、これはRPSの単粒子検出技術のおかげで、各粒子に対して正確な特徴付けを実現することができる。

実際のサンプルの測定により、著者らは4つの異なる粒子特性評価方法の特徴をまとめた（表1）。著者はNTAは粒子粒径分析において良好な解像度と高い精度を有し、2-3種類のモードのサンプルを区別することができるが、外分泌体類のサンプルに対して、NTAは外分泌体、嚢胞と脂質蛋白を区別することができず、同時にNTAも異なる源の外分泌体を区別することができない。DLSについて、著者らはこの方法は非常に簡便で、微量サンプルで測定を完了することができると考えているが、この方法で測定された粒径値は実際の状況に比べてばらつきが大きく、この方法ではサンプル粒子濃度を測定することができない。TEM法はサンプル粒子の可視化測定を直接実現することができるが、この方法はコストが高く、手間がかかる。RPSについて、著者らはこの方法が粒子の真の粒子径を直接測定することができ（特に未知のサンプルの粒子特徴の場合）、多モードの混合サンプルに対して良好な分解能があると考えている。

表1.4種類の異なる粒径分析方法の特徴まとめ

この作業を通じて、著者らのシステムは濃度、計器閾値、露出度、ポンプ流速などの要素がNTAの性能に与える影響を評価し、彼らは発見した濃度が10⁸~10⁹、ポンプ流速が50 AUの場合、粒子サンプルに対して比較的正確な特性評価結果を得ることができるまた、同時に、彼らは計器閾値と露光度の2つのパラメータについては、サンプルの粒径の具体的な問題に合わせて具体的に分析する必要がある。同時に、彼らは発見したNTAは多分散サンプルの分析能力がよくないが、RPSは三峰または四峰サンプルを区別することに成功し、RPSが多分散サンプルに対してより優れた区別能力を持っていることを示している。同時に著者らは多種の特徴づけ手段を用いて2種類の外分泌体を分析し、それぞれの特徴づけ手段によって得られた粒子径と濃度は異なるため、著者らは生物学的粒子の研究を行う際には、直交法を用いて粒子の多重特性化を行う必要がある。

参考文献