米タフズ大学（タフツ 大学）の研究者らは、NTA−FLに対する蛍光免疫マーカーの単一EVの最適化アルゴリズムを報告し、NTAに基づく単嚢胞免疫マーカーと検出と粒度分布と濃度分析をより正確にした。このアルゴリズムはNTA検出結果の信頼性を効果的に向上させ、EVの機能とメカニズムをより深く研究するための強力なツールを提供することができる。

前の研究では、研究者たちは伝統的な利用国家税務機関行うEV のサブタイプ分析の蛍光/散乱光照合方法はデータがずれてしまう場合があります。通常、蛍光（FM）曲線に囲まれた面積と散乱光（LSM）曲線に囲まれた面積の比はEVの純度を表すことができる。しかし、これらの研究者たちは分析の過程で、テスト1、2、4（表1、図1）において、FM（ブルーライン）とLSM（レッドライン）の比が100%より大きく、EV純度が100%より大きいことを示しており、これは明らかに不合理であり、このテスト結果は以下のことを示している：

1.蛍光検出中に、大量の偽信号が発生した可能性がある。

2.NTAシステムの技術的制約により、LSMは非常に小さいEVや屈折率の低い他の粒子を検出できない。散乱光モードではEV検出が不十分で、一部のEVデータが検出されず、LSM面積が小さくなり、比が100%を超える結果となった。

3.研究者はまた、FMモードが50 nm以下の領域にはまだ明らかな信号ピークが現れていることを発見した。一方、LSMモードを比較すると、50 nm以下の信号は基本的に0に減衰しており、これも100%以上の比率をもたらす原因の一つである可能性がある。具体的には、これは遊離した蛍光分子が十分に除去されていないことと、系中の遊離した蛋白質が蛍光分子に標識されて、小さいサイズのパーティションにおける蛍光信号の増強をもたらしている可能性がある。

このような状況を解決するために、研究者たちは2つの評価方法を提案した：

第1の方法は、サンプル中の50 nmより大きい粒子の数を計算し、FMとLSM中の粒子の数を比較してFMとLSMの間の割合を得る伝統的な計算方法である。（図2 b，c）

第2の方法最適化された計算方法であり、2つの方法で得られた粒度分布曲線間の重複領域を計算し、この領域とLSM中の50ナノメートルより大きい粒子の総数を比較し、重複領域の割合を導出する。（図2 d）

研究の過程で、研究者は彼らの粒子径選択の取捨選択を重点的に強調した。EVをより正確に解析するために、研究者は解析範囲を50〜200ナノメートル。この範囲を選んだのは、ほとんどのEVのサイズはこの範囲内ですをオフにします。LSMは50ナノメートル未満の粒子検出能力に限界があるで、200ナノメートルを超える粒子はEVではない可能性があります。そのため、解析範囲を50-200ナノメートルは他のタイプの粒子を効果的に排除し、分析結果の正確性を高めることができる。

図2 NTAに基づく免疫マーカーアルゴリズムの概略図

表2アルゴリズム最適化後の異なるサンプルの蛍光面積（FM）と散乱光面積（LSM）比（SA）

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