干物：MISEV 2023ガイドライン解読（一）：EVの特徴
日付：2024-09-26読み：0
待望の最新MISEVがついに千呼万呼で始まりました！細胞外嚢胞（EV）は発見以来広く関心を集め、関連する科学研究の数も年々安定的に増加している。EVの計量及びEVの理解と応用において重要な進展が得られた。しかし、EV命名、非嚢胞細胞外粒子の分離、EVsの特徴付けと機能研究の挑戦により、EVの基礎生物学から臨床応用などの分野を実現することには依然として障害がある。この急速な発展分野の挑戦とチャンスに対応するため、国際細胞外嚢胞学会（ISEV）は2014年に初めて発表された「細胞外嚢胞研究のための最少情報ガイドライン（MISEV）」を更新し、2018年に1版更新（MISEV 2018）を行い、EVの特性評価についていくつかの実験方法を提案し、2014版をベースにより深く批判的な評価を行った。4年1期の業界宝典は「マスク」事件などで遅れていたが、甲辰竜年の際に浮上し、EV分野の新たな1年の方向性を示した。最新リリースのMISEV 2023は、初めてposition paper（立場意見書）としてはい定期刊行物では、研究者に利用可能な方法を提供するための最新の提案と、さまざまなソースEVの製造、分離、特性化における利点と限界を提供することを目的としている。EV研究の基本原理を紹介する新技術のほか、現在この分野で最先端の技術と方法をカバーしている。そして、私たちはすぐに見ることができます：
EVの推定数、EVの存在の決定、EV製造における非EV成分のシェアと影響の評価などはEVを特徴づける必要がある。EVの特徴付けは、小粒径、寸法異質性、分子異質性、汎用EV識別方法の欠如、および多くの測定技術の非EV特異性の挑戦に直面している。すべてのEVキャラクタリゼーションの要件を満たす測定または方法はないので、直交法（つまり同じ測定制限がない方法）を使用して相互に検証することをお勧めしますすなわち、EVの特性化パラメータは、重要品質属性（CQA）として2つ以上の異なる原理を用いた方法で同じ指標を検出することを推奨している。
EVの全体組成（タンパク質、脂質、核酸及びその他の生体分子等の含有量及び割合）はEV源によって異なる。これらの単一分子クラスの測定はEV存在度の推定に使用できるが、これらの値はEV濃度のすべてに関連するとは限らず、ソース材料間にも普遍性は存在しない、そのため、EV濃度の測定基準としては使用されません。すべてのEVを定量化できる単一分子の検出がないように、EVやEVサブタイプの汎用分子マーカーもありません。ソース特異性とタイプ特異性の証拠に基づいて特定のタグを選択する必要があります。現在、ソースに関係なく、すべてのEVを識別できる既知の汎用タグはありません。いわゆる外分泌体については、これらの標識の一般性は不明であるか、受け入れられていない。4次膜貫通タンパク質CD 9、CD 63、CD 81に関する親和性に基づくスキームはEV亜型の外分泌体として特異的ではないことに注意してください。これらの4次膜貫通タンパク質のいずれかに対する抗体濃縮を用いたEV集団は、すべての分子組成を全面的にカバーしないわけにはいかない。また、すべてのEVsがこれらのタンパク質マーカーを発現しているわけではないので、4次膜貫通タンパク質濃縮はすべてのEVsを捕捉することはできない。同一の特性化パラメータを検出するための直交方法（複数の原理の方法）同じ偏差を持つ可能性はあまりありません。例えば、EVの直径は、同時に光学的方法と非光学的方法によって導出され、検出される。直交法を用いてEVサンプルを特性化することは、共分離物がバイオマーカーや機能発見と無関係であることを証明するためにも重要である。多くのEVキャラクタリゼーション方法はEVに対して特に適していないか、すべてのEVを検出することができないため、EVデータの再現性を確保するために方法と結果を透明に公表する必要がある。
EVの数は体積測定とともに数濃度（particles/mL単位）を定義しており、広く報道され使用されている指標である。しかし、多くの技術がEVに対する特異性とすべてのEVに対する感受性に欠けているため、通常は信頼できない。ISEVの厳格かつ標準化されたEV参照材料ワーキンググループは最近、トレーサビリティ測定、開発、および良好な特性評価を報告するEV参照材料に直面する上で、測定技術の考慮要素を概説した。この作業の重要なポイントの1つは、感度制限にかかわらず、他の人が結果を検証できるように、検出方法のLODを公表する必要があることです。直交法を用いることでEV濃度測定の信頼性を高めることができる，各方法は、光散乱強度の検出など、決定されたLODを有する（NTAなど）、蛍光強度（例えばFCM）および物理サイズ（例えばRPS）、直交法には同じ測定制限がないため。例えば、抵抗パルス誘導（RPS）技術では、LODを粒径で表すことができる。フローサイトメトリーなどの光学技術については、LODは、光散乱光学モデルに由来する直径または蛍光強度に由来する等価可溶性蛍光団（MESF）分子を用いて報告することができる。これらの方法は、異なる機器と感度の間に一貫したデータを生成することができる。粒子検出に関わる変数が多いため、現在、ナノ粒子追跡分析（NTA）、動的光散乱（DLS)またはイメージングフローサイトメトリーによるトレーサビリティLOD。EVと他の潜在的な共分離物や汚染物を区別できない技術については、上流分離工程にかかわらず、濃度報告書を「EV濃度」ではなく「粒子濃度またはEP濃度」と表現することを推奨している。
EVサイズ（ナノ半径または直径単位）の測定は球形度や移動度などの仮定に依存し、出力結果は上流変数の影響を受ける可能性がある。一般的な高スループット法には、フローサイトメトリー、NTA、RPS、多角光散乱と動的光散乱（DLS）の両方はEVが球形であると仮定している。「サイズ」と「直径」は測定方法間で相互に使用されることが多いが、その導出方法は測定技術間の一貫した違いをもたらす可能性もある。たとえば、NTAやDLSなどの粒子ブラウン運動に依存して測定されるのは流体力学的直径であり、冷凍電子顕微鏡などのイメージング方法に比べて粒子サイズの推定が高すぎることがある。EV全体の可能な直径範囲（数十ナノメートルからミクロン）でEVサイズを正確に測定する方法はほとんどありません。例えば、冷凍電子顕微鏡の高解像度イメージングは最も正確な方法の1つであるが、その検出フラックスは相対的に低く、多くの大きなEVは数量が少なく、定量化できない可能性がある。100 nm未満の低コントラストEVを定量化する能力も制限要因になり得る。
より感度の高い専用の単粒子分析技術を使用する研究者が増えるにつれ、EV製剤の多くは対数正規分布のような非対称な右偏分布を示し、その多くはEV直径が100 nm未満であることが明らかになってきた。多くの単粒子分析技術はEV集団全体を解析することができないため、研究者は検出されたEV直径分布を共有すべきである，平均サイズ、集中サイズ、中央値サイズなどの集約指標だけでなく、これらの指標はLODと非対称サイズ分布により傾斜しやすい。注意してください、適合サイズ統計データ、例えばNTAによる低屈折率粒子の測定は、EV集団の真のモード直径ではなく機器のLODに近い可能性がある。独自のアルゴリズムを持つソフトウェアを使用して粒径を決定する技術は、ソフトウェアバージョンまたはソフトウェアプラットフォーム間の違いをもたらす可能性もあるので、ソフトウェアとそのバージョンも提供する必要があります。屈折率仮説から大きさを導出する技術は、異なるサンプル成分と積載物によって変化する可能性がある。蛍光プローブ（例えば膜埋め込み染料）から導出される大きさは、膜脂質成分に基づく異なる染料の埋め込みによって変化する可能性がある。EVと共分離物/汚染物質を区別できない技術については、上流分離工程にかかわらず、直径報告書を「EV直径」ではなく「粒子」または「EP」直径と表記することを推奨している。
三、EVキャラクタリゼーション技術特定報告書の注意事項
EV検出実験や機器の使用や専門家の知識の拡大に伴い、データの信頼性と再現性を確保するために、関連特性評価報告尺度の決定も増加している。MISEV 2023ガイドは、最小実験と機器特定報告の注意事項リストを詳細に示している。これらは通常、実験設計にかかわらず適用されます。ここに挙げた技術は詳細ではなく、多くの検出技術が開発されているか、積極的に研究されている。しかし、列挙された技術はすべて商業的に入手可能であり、複数の研究者からの発表文献がある。（紙面の制限のため、筆者はここでは現在一般的に使用されているいくつかのEV粒子径と濃度特性化ツールの説明とその主要な観点のみを列挙する）ISEVは、対照群は、検出抗体としての同型抗体、または同型カップリングされた捕捉微小ビーズ、および検出抗体のみを含む捕捉微小ビーズ（抗体被覆のための捕捉ビーズ）、複数のEVサンプル濃度を用いて信号の滴定を示すべきである、マイクロビーズを製造する場合は、その試薬と化学成分を公表しなければならない。商業的に捕獲されたマイクロビーズ試薬の目録とロット番号も公表しなければならない。標準化微小ビーズの中位蛍光強度値を公表する、一重項トラップ微小球からの等価可溶性蛍光団（MESF）分子のデータと中位蛍光強度値統計（単EVフローサイトメトリーと同様）を公表し、完全かつ詳細な方法学を公表すべきである。2023年、国際細胞外嚢胞学会（ISEV）、国際細胞計数進歩学会、国際血栓と止血学会からなる三学会工作グループ（EV流式細胞術工作グループ）の提案を経て、『単EV流式細胞術要綱』を出版し、単EV流式細胞術の開発に関する注意事項を全面的に解決した。サンプル体積、蛍光及び光散乱パラメータの較正は、単一EVフロー結果の解釈及び複製にとって重要である。単一EVフローサイトメトリーを使用して粒子濃度を報告する場合は、直交法または他の人を使用して結果を繰り返し検証できるようにLODの上限と下限を決定します。現在、イメージング細胞計は動的トリガ方法を使用しており、これにより、低いLODの決定は定義が困難であり、標準化が困難である。DLS，光子相関分光法（PCS）及び準弾性光散乱（QELS）とも呼ばれ、希釈水溶液分散液中の十分な単分散粒子の流体力学的直径を決定することができる技術である。DLSは溶液中の複数の粒子散乱のレーザ強度の自己相関関数を測定する。自己相関関数は、ストークス・アインシュタインブラウン運動理論によって流体力学直径に相関する粒子拡散係数に関する情報を運ぶ。拡散係数は、測定された自己相関関数から複数のアルゴリズムを用いて導出することができる。最も一般的な方法は累積量分析ですが、サンプルはすべて単分散の大きさ分布であると仮定していますが、EVサンプルはこの分布を備えていません。EVサンプルの多分散サイズ分布に対して、拡散の導出自己相関関数の係数分布は不適な数学的問題となっている。これは、DLSはEVサンプルの定量的特性を決定するために使用されてはならない、DLSがEVの単分散サイズの一部に適用されない限り。一方、DLSは、EV試料中に存在する可能性のあるサブミクロン粒子と可能な凝集体の存在を定性的に確認するために使用することができる。各種電子顕微鏡（EM）は、EV（大きさにかかわらず）を検出できる数少ない技術の1つです。しかし、電子顕微鏡のフラックスも、比較的小さなEVsと比較して、比較的大きなEVsが統計的に過小評価されることを意味する。SEM、TEM、Cryo-EMはいずれも高解像度のEVキャラクタリゼーション方法であり、それらは互いに切り替わる必要もなく、あるいは品質比のある画像を提供することもできる。たとえば、Cryo−EMは、試料を固定するためのTEMの脱水条件よりもEV形態を良好に維持し、より正確に定量（大きさ）することができ、グリッド表面に付着した粒子だけでなく、体積中のすべての粒子を画像化することができるからだ。低報告要件を決定するためのEM方法の標準化研究は非常に限られている。TEMについては、固定、吸着、負染色方法の3つの主要パラメータを公表しなければならない。固定には、使用する固定剤及びその濃度及びインキュベーション時間、吸着には、メッシュ材料、メッシュサイズ、フィルムタイプ、コーティング、インキュベーション時間、洗浄詳細が含まれる、負染色の詳細には、基質、濃度、およびインキュベーション時間が含まれるべきである。また、低倍率及び高倍率画像及び画像の選択基準を公表すべきである。NTA，単粒子追跡でもあり、EV分野で広く使用されている光学技術であり、粒子サイズと濃度を推定するために使用されている。NTAは通常、直径分布の変化を低減するアルゴリズムを用いて、粒子の拡散係数を測定することにより流体力学直径を得る。注目すべきは、一部のNTAデバイスで使用されているFTLAアルゴリズムは、単分散混合物をよりよく表現するために開発されていますが、EVはそうではありません。これにより、人為的な複数のフィッティング分布が生じる可能性があります。なお、NTA設定のLODを特定したり公表したりする方法は現在のところない。多くの学者がユーザーと機器間の結果を比較するためにいくつかの標準化研究を行っている。NTAを用いた複雑な生体流体試料の直径分布と濃度の測定については慎重に説明する必要がある、リポ蛋白質と大蛋白質複合体などの共分離物を計数し、NTAは直径が数百ナノメートル以上のEVを定量化することが困難である。NTAの公開情報には、機器モデル、カメラタイプ、カメラ設定、レーザー波長、レーザーパワー、ソフトウェアバージョン、解析設定、フレームごとのパーティクルが含まれている必要があります。既知であれば、使用するアルゴリズムによって異なる結果が生じる可能性があるため、直径分布を生成するためのアルゴリズムを公開する必要があります。光散乱や蛍光検出モードの場合は、対照としてブランクバッファを使用することを推奨します。蛍光NTAについては、光散乱モードにおける総粒子数及び蛍光モードにおける標識粒子数、並びに標識除去方法及び緩衝液/試薬制御による標識の偽彩色状況の評価を報告する。流体サンプリング装置を使用している場合は、その設定も公表する必要があります。これはMISEVが初めて抵抗パルス誘導（RPS）技術をフローベースの方法（マイクロビーズベースのフローとシングルEVフローを含む）と顕微鏡ベースの方法（原子間力顕微鏡、電子顕微鏡、DLS、NTA、超分解能顕微鏡などを含む）と並列して推薦する通常のEV粒子特性化方法とした。数少ない非光学原理のEV特性化技術の一つでもある。RPSはクルト原理を利用して粒子の濃度と直径を決定し、一部の装置はゼータ電位機能も備えている。現在、RPSの直径LODは〜50 nmまで低い。文献によると、RPS測定結果は確かにTEMデータは非常に高い一貫性を持っています。RPSデータを報告する際には、機器の型番、開口、校正ビーズの直径とソース、ソフトウェアバージョンを公表することを提案します。先に述べたように（粒子サイズの定量）、EVデータに対して、単一直径統計データではなく、RPSの直径分布を公表することを推奨します。また、ブランク緩衝液の対照を取り入れて背景を識別することを提案した、及び同じ濃度の洗浄剤を分解した後のサンプルを用いて標識事象を決定した。RPS技術は大きな粒子で詰まりやすいため、遠心分離やろ過などの分析前のステップを使用して大きな粒子を除去することができる。これらの方法は分析中のEVグループを変更し、直交法との比較に影響を与える可能性があるため、分析前の処理手順を明確に説明する必要があります。タンパク質の濃縮と定量の詳細情報を提供する必要があります。可能であれば、抗原の陽性および陰性対照を含む必要がある、タンパク質がEVと関連していると主張する場合は、EV製剤を含む純度測定が必要である。標準化されたサンプル、ゲル電気泳動、転膜方法、プローブ、イメージング/分析のすべての詳細（抗体情報、サンプル変性と還元条件、転膜方法、膜タイプ、緩衝液、イメージング装置とパラメータを含むがこれらに限定されない）を報告する。すべてのWBの切り取られていない画像を提供します（ジャーナルに掲載されている場合は補足情報として必要です）。このガイドラインでは、上記の各章で、EVキャラクタリゼーションの異なる方法をそれぞれ検討し、具体的な提案を提供しています。どのような方法を採用しても、特徴付けの全体的な提案は以下のようにまとめられている：
- 各EV製剤は、EV源の定量的測定（例えば、分泌細胞の数、生物流体の体積、組織の質など）によって定義されるべきである。
- EVの存在度（粒子数、タンパク質及び／又は脂質含有量を含む）を推定すべきである。
- EV製剤にEVサブタイプまたはEVに関連する成分が存在するかどうかを測定すべきであり、具体的には実験目的に必要な特異性に依存する。
- 定量的指標を用いてEVを特性化する場合、機器または方法の検出限界（LOD）を提供する必要がある。
