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　　PNA合成条件を多機能マルチチャネルのPurePep Chorusを用いて迅速に最適化する

ペプチド核酸（PNAと略称する）はポリペプチド骨格を有するDNA類似体であり、多種の物理化学的性質を有する。PNAの主鎖骨格は、N（2−アミノエチル）−グリシンと核酸塩基がメチレンカルボニル基を介して連結されている。

図1：ペプチド核酸の構造概略図、及びDNAとの結合

ペプチド核酸非イオン核酸類似物は、PNAが負電荷を持たず、DNAとRNAとの間に静電反発力が存在しないため、結合の安定性と特異性はいずれも大きく向上し、DNAまたはRNA分子とのハイブリダイゼーション能力はDNA/DNAまたはDNA/RNAよりはるかに優れ、高いハイブリダイゼーション安定性、優れた特異配列識別能力、核酸酵素とプロテアーゼによる加水分解されないことを示している。

PNASはRNAs結合により相補的に遺伝子発現を抑制することができる。また、特定の条件下では、鎖侵入機構とDNA二重鎖配列との結合により遺伝子発現を促進することもできる。以上の利点に基づいて、ここ10年来PNAは多くの分野で広く使用され、高い親和性と特異性は治療剤になるだけでなく、診断の応用にも有力なツールになっている。

PNA基礎研究の継続的な深化と新技術の継続的な出現に伴い、PNAはより良い性能とより広い応用の将来性を示すだろう。

　　現在の課題

合成過程で重合が起こりやすく、脱保護過程で副反応が多いため、PNASの合成には大きな課題がある。重合が容易であるという問題に対して、通常の戦略は、縮合反応に過剰な試薬を使用することである。しかし、合成のためのN末端保護のためのPNAモノマー試薬は比較的高価であり、この方法は広く応用されていない。そのため、PNASが商業化に成功するのを助けるためには、比較的コスト効率の高い合成プロセスを開発しなければならない。

　　PurePep Chorus上での合成条件の最適化

本文では、PNAの合成条件の迅速な最適化をPurePep Chorus自動合成器で実現することを示します。

PNA 1は、PNAモノマーの過剰係数、反応時間、温度などの異なる合成パラメータを調べるためにシーケンスを参照するために使用される。PNA 1の純度が最も高い条件を合成することは、他の5つの長さ及びプリン（アデニン及びグアニン）含有量の異なる配列の合成に使用される（表1参照）。純度は合成を考察する重要な要素であり、PNAモノマーの空間位置抵抗が大きいため、縮合反応の不完全による低純度を引き起こしやすい。

表1：今回のケースに係るPNAシーケンス情報

PNA 1はPurePep Chorusポリペプチド合成器を用いて合成し、合成当量は25μmolで、置換度が0.27 mmol/gのRink Amide MBHA樹脂を使用し、Fmoc/tBu直交保護方案に従う。樹脂上のFmoc基の脱保護は20%ピペリジンDMF溶液を用い、室温で5分間×2回反応させる、縮合反応にはHCTUとNMMの系を用い、具体的な反応詳細は表2を参照。縮合反応終了後、末端封止操作を行い、10%無水酢酸DMF溶液を用い、室温で5分間反応させた。最後の脱保護終了後、樹脂を切断液（TFA：TIS：H 2 O＝95：2.5：2.5）に入れ、室温で4時間反応させた。

以上の操作はChorus上で必要な条件に基づいてソフトウェア上に異なるProtocolを設定することができ、ソフトウェアは自動的に必要な試薬量を計算し、機器は自動的に動作し、より大化して人手操作を節約し、そして試験案が厳格に実行されることを確保する。

表2縮合条件の検討

表2のデータ分析から、PNAの反応当量数が10倍の場合、生成物粗品の純度は81%に達し、しかし、合成原料であるFmoc−PNAモノマーは価格が高く、上記の設計は受け入れられにくい。PNAの反応当量係数を4倍に下げ、粗製品の純度を72%に下げた。この時、PNAの反応当量係数を4倍に維持し、反応温度を45℃に上昇させ、縮合時間を5分に減少させ、生成物粗品の純度をさらに61%に低下させた。このことから、縮合反応には5分間の反応時間が短すぎることがわかる。この時、他の条件は変わらず、単独で反応時間を10分（実験D）に増加し、粗ペプチド純度は82%に達し、実験Aの結果と近い。実験Eは反応の条件をさらに考察するために用いられ、反応当量係数は2に調整され、2回の添加反応を行った。総量が同じ反応原料を使用し、同じ縮合時間で生成物粗品の純度を5%向上させた。

PNA 1生成物の純度の最高値に基づいて合成条件を決定し、残りのいくつかの配列はPNA 1と同じ方法で合成される（すなわち方法E）。結果を表3に示す：

表3：方法Eを用いた残り5本のPNAの粗品結果の合成

上記5つのPNA合成後の生成物の粗純度は66〜91%であり、このような結果はペプチド核酸にとって好ましい。興味深いことに、プリン含有量の高いPNA生成物はより高い純度を持っている。

図2：5本のPNAS生成物を210 nm波長でUPLC−UVシステムで採取したクロマトグラム。UPLCシステムはWaters H-class UPLC/ESI-MS、カラムはC 18（1.7μm、2.1 x 50 mm）である。水（A）とアセトニトリル（B）との混合溶液中の移動相0.1%TFA。

　　まとめ

この応用文献では、PurePep Chorusシステムを用いてPNA合成を最適化する方法を詳細に議論した。最初に我々は10倍の反応当量のPNAを用いて室温で1時間縮合反応させ、このような方法で純度81%の生成物粗品を得ることができる。我々は反応物の使用量を低減し、粗製品の純度への影響を最小限に抑え、その反応をより経済的で持続可能で、グリーン化学の要求に適合させることに力を入れている。最終的には反応物の使用量を減らし、純度も高い方法を開発した。2回の縮合を用いて、1回の添加につき2倍の反応当量を用いて、45℃の条件下で5分間反応すると、PNA 1の粗製純度を81%から87%に高めることができる。最後にこの方法を他の5つのPNAの合成に倍適用した。

長さとプリン含量の異なるペプチド核酸に対して、この方法はいずれも良い産物を得ることができる。PurePep Chorusポリペプチド合成器はこの作業にとって良いツールであり、合成の方案は必要に応じて柔軟に調整できるため、例えば、反応当量係数、繰り返し回数、温度及び時間を修正する。同時に、自動化された計器とソフトウェアの自動計算機能は人工操作を減らし、ミスのリスクを下げ、最適化された合成条件は他のPNAS合成に簡単に応用できる。