α-メラニン細胞刺激素（α-MSH）はメラトニンの産生を触発することを担当し、メラトニンは人体が紫外線（UV）放射線を防ぐ天然保護である。紫外線に肌を曝すとα-MSHの発生が促進され、しかし、紫外線曝露前にメラトニンを刺激する生合成は、紫外線による皮膚癌を予防する可能性がある。

天然形態のα-MSHが体内で不安定すぎて治療剤として投与できないことを考慮して、人々は異なる類似物を合成し、その中の1つはMT-II（図1）であり、酵素分解に対して高い抵抗性と非凡な効力を持つ環状ペプチドである。

図1

　　MI-IIの生産は臨床需要を満たすためにKGレベルに拡大する必要があるため、実験室規模でのプロセス条件の最適化はプロセスの拡大可能性を考慮しなければならない。

　　

　　Gyros Protein Technologiesは実験室から中間試験レベルのポリペプチド合成器を提供し、技術開発段階から商業化生産への順調な拡大を支援する。

本文の実例は全自動合成のルートの最適化と増幅、すなわち線形配列の合成と最終ペプチドの樹脂上のラクタム化を討論する。この作業では、MT-II大規模合成の最適化は3段階に分けて行われます。

　　1樹脂の上環化の適切な保護方案を見つける、

　　2PurePep Chorusを用いて小規模に合成条件を最適化し、リング化を完了し、計器は全自動で動作する。

　　3中間規模合成器PurePep Sonata+において、先に最適化された条件を用いてMT-IIを増幅合成した。

　　01適切な樹脂上環化保護方案を探す

MT−IIの構造はアスパラギンとリジンの間にラクタムブリッジを形成した後に完成し、これらの残基は樹脂上環化工程の前に選択的に保護する必要がある。したがって、除去を伴うことができる側鎖保護基を見つけることが理想的であり、脱保護の困難さを最小限にすることができる。本実験の第1段階では、異なる組み合わせの側鎖保護基を用いてMT-IIを合成した：

1Asp（ODmab）/Lys（ivDde）

2Asp（O-2-PhiPr）/Lys（Mtt）

3Asp（OAlly）/Lys（Alloc）

2%ヒドラジンのDMF溶液、1%TFAのDCM溶液、及びパラジウム−テトラキス（トリフェニルホスフィン）（Pd（PPh 3）4）及びフェニルシラン（PhSiH）のDCM溶液を用いて同時に選択的に除去することができる。最終ペプチドの粗純度を表1に示す。

表1側鎖保護基の異なる組み合わせで合成したMT-II粗ペプチド純度

異なる保護スキームを比較すると、2を組み合わせて得られた粗ペプチドの純度が最も高かった。しかし、Fmoc-Asp（O-2-PhiPr）-OHは比較的高価であり、後続の増幅生産にコストがかかる。組み合わせ1で得られた粗ペプチドの純度は最も低く、これは2%ヒドラジン処理によるODMabとivDdeの脱保護効果が不十分であることに起因する。さらに、組み合わせ3は組み合わせ2よりもはるかに低い粗純度を示しているが、これは主にアスパラギンの形成に関係していると分析されている。この副反応を最小化することにより、粗ペプチド純度を顕著に高めることができる。そこで、合成MT−IIモノマーとしてAsp（OAlly）／Lys（Alloc）を選定し、次の最適化を行った。

　　02 小規模最適化縮合条件

最初に、予備活性化（4）および予備活性化5分（5）なしのカップリング工程に対するDICとOxymaPureの使用を検討した。これらの方法は、組み合わせ3と同様に、アスパラギンの形成により粗ペプチド純度が著しく低下した（表2）。したがって、MT−IIは、ペプチドをHis（His−D−Phe−Arg−Trp−Lys（Alloc）−樹脂）に合成し、HCTU／NMM（6）またはDIC／OxymaPure（7）を用いてAsp（OAlly）の縮合を行う段階的に合成される。アスパラギン酸イミドの形成が観察されなかったAsp（OAlly）縮合後、マイクロ切断を行った。これらの断片の粗純度は88.9%であった。

表2異なる条件下での合成MT-IIの純度

　　線形ペプチドの合成

線形MT−IIはPurePep Chorus上で100μmol規模でRink Amide MBHA樹脂（0.35 mmol/g）上で合成した。合成に先立ち、樹脂をDMF中で2×10分間膨潤させた。脱保護工程は20%ピペリジンDMF溶液を用いて2×5分間、縮合工程は5当量AA、5当量DIC及び5当量OxymaPure DMF溶液中の（無プレ活性化−4、又は5分間プレ活性化−5）を用いて室温で30分間継続する。セグメント7と9の場合、Asp（OAlly）とNleは5と同じ条件で縮合する。フラグメント6と8については、室温で、Asp（OAlly）とNleとHCTU（5当量）とNMM（10当量）をDMF中で縮合し、予備活性化時間は5分、単回縮合時間は30分であった。MT−IIの末端アミンを室温で10%Ac 2 OのDMF溶液で30分間アセチル化した。

Asp及びLys側鎖保護基の選択的除去：Asp（OAlly）及びLys（Alloc）の脱保護用0.2当量Pd（PPh 3）4を用いて24当量PhSiHのDCM溶液を室温で2回60分間洗浄した後、DCM及びDMCでそれぞれ3回洗浄した。

　　樹脂上環化

室温で、ピオキシム（5当量）とDIPEA（5当量）を用いてDMF溶液中で60分間樹脂上環化を行った。

　　切断

樹脂をDMFで3回、DCMで6回洗浄し、その後20分間乾燥した。各切断用TFA/EDT/H 2 O/TIS（94：2.5：2.5：1）の混合物を室温で60分間行い、その後エーテル中で沈殿させた。

　　03在PurePep ソナタ+上放大MT-II的合成

PurePep Chorus上で小規模な最適化合成を行った後、スキーム8を最適スキームとして得た。PurePep Sonata+上でMT-IIを大規模（5 mmol）に合成した。

請求項8の合成方法及び条件によれば、MT−IIはPurePep Sonata+上でAsp（OAlly）【Fmoc−Asp（OAlly）−His−D−Phe−Arg−Trp−Lys（Alloc）−樹脂】まで合成した後、側鎖保護基を選択的に除去し、その後の樹脂の上環化に用いた。環化後、NleとN末端アセチル化を加えることにより配列が完成した。この戦略により、PurePep Chorus上で0.1 mmol規模の粗ペプチド純度を合成したのと同等の粗純度80.2%のMT-IIが得られた。

　　結論

●PurePep Chorus多チャンネル多機能全自動合成器では、小規模なMT-IIの合成を実現し、異なる合成条件の探索と最適化を行うことができ、その後、最適な合成条件をPurePep Sonata+上に順調に置くことができ、合成規模は100µmolから5 mmol（50倍増加）に拡大し、得られた粗ペプチド純度は80.1%とほぼ一致した。

●この研究はPurePep Chorusの柔軟性のおかげで、MT-IIは最初から最後まで全自動合成：線形ポリペプチドから選択的側鎖脱保護と樹脂上環化まで、ステップごとに異なる縮合条件を選択し、合成中にオンラインマイクロ切断抽出サンプルを行って試験を行い、実験結果に基づいて条件を調整することができる。PurePep Chorus上のプロセスのスムーズな移行はPurePep Sonata+に拡大され、同じ結果が得られます。