（実験サービス）リアルタイム蛍光定量PCR

1.サービスの概要

（実験サービス）リアルタイム蛍光定量PCR（Quantitative Real-time PCR、qPCR）とは、PCR増幅反応系に蛍光基を加え、蛍光信号蓄積を利用してリアルタイムにPCRプロセス全体を監視し、最後に未知のテンプレートを標準曲線で定量分析する方法を指す。分子生物学研究における「金標準」技術として、qPCRはその感度、特異性と正確性によって、遺伝子発現分析、病原体検出及び遺伝変異研究のツールとなっている。

私たちはPCR検査プラットフォームに頼って、サンプル核酸抽出、逆転写、qPCRのデータ分析への増幅のワンストップ技術サービスを提供します。

2.技術原理と方法

我々は2つの主流の検出戦略を提供し、異なる実験ニーズを満たす：

• SYBR Green I染料法：

• 原理：SYBR Green I染料は二本鎖DNAの小溝に特異的に結合でき、結合後に蛍光信号が増強される。PCR生成物の増加に伴い、蛍光信号は同期的に増強される。

• 適用：遺伝子発現差異の初期スクリーニング、大規模サンプル検査、コスト感受性プロジェクト。溶解曲線（Melt Curve）分析を組み合わせて、増幅産物の単一性を確保した。

• TaqManプローブ法：

• 原理：プローブは完全時に蛍光がなく、増幅過程におけるTaq酵素の加水分解作用は蛍光基を切り離し、蛍光を発する。

• 適用：高特異性は実験、多重PCR検査（Multiplex PCR）、SNP分型、微量サンプル検査を要求する。

3.サービス内容と全プロセス

私たちは厳格に標準化された操作プログラム（SOP）に従って、各ステップの正確で制御可能なことを確保します：

段階1：実験設計と最適化

• プライマー/プローブ設計：目的遺伝子（Target Gene）に対して、ゲノムDNA汚染の妨害を回避するために、トランスイントロンプライマーを設計する、内参遺伝子（GAPDH、ACTB、18 S rRNAなどのHousekeeping Gene）をスクリーニングした。

• プライマー特異性を通常のPCR及びアガロースゲル電気泳動により検証し、アニール温度を最適化した。

第二段階：サンプル処理

• 核酸抽出：

• 逆転写（cDNA合成）：mRNAに対してOligo（dT）またはランダムプライマーを使用する、miRNAに対して茎環プライマーまたは加尾法を用いて、逆転写効率の均一化を確保する。

第三段階：オンライン検査

• システム構築：高忠実qPCR反応システムを配置し、少なくとも3つの技術重複（Triplicates）を設置し、サンプリング誤差を解消する。

• プログラム実行：リアルタイムで蛍光信号を収集し、増幅曲線を生成する。

フェーズ4：データ解析

• 採用2−ΔΔCT法により、対照群に対する実験群の遺伝子発現差異fold changeを計算した。

  
  

• 定量：プラスミド標準品を構築し、標準曲線を描き、サンプル中の目的遺伝子の正確なコピー数を計算する。

  
  

4.デルのコアメリット

1. ハードウェアプラットフォーム：

2. 厳格な品質管理システム：国際的なガイドラインに従うMIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）をオフにします。増幅効率（90〜110%）と線形関係（R²>0.99）を厳格に監視し、偽陽性/偽陰性を根絶する。

3. 複雑なサンプル処理：豊富なFFPE切片、微量組織、外分泌体及び全血サンプルの処理経験を持ち、PCR抑制剤を効果的に除去する。

4. 専門的なデータ配信：元のCt値を提供するだけでなく、増幅曲線図、溶解曲線図、相対発現量ヒストグラム/熱図を提供し、そして詳細な実験材料と方法を含む完全な報告を生成し、直接SCI発表要求を満たす。

5.シーンを適用する

• 異なる処理条件または疾患モデルにおけるmRNA、lncRNA、circRNAの差異発現検証（RNA−seq後のqPCR検証）。

• miRNA検出：微小RNAの発現制御研究。

• DNAコピー数変異（CNV）：腫瘍遺伝子の増幅または欠損検出、トランスジェニックコピー数の同定。

• SNP分類検証：単ヌクレオチド多型部位の遺伝子型同定。

• 病原微生物検査：ウイルス担持量測定、細菌定性定量分析。

• ChIP qPCR：染色質免疫沈殿後のDNA断片濃縮を検証し、蛋白質−DNA相互作用を研究した。

6.送料要求と交付基準

• サンプル送付の提案：

• 細胞： 細胞沈殿＞

• 1*10^6，PBS洗浄後急速凍結。

• 組織：動物組織>50 mg、植物組織>100 mg、液体窒素急速凍結またはRNAlater保存

• 全血には抗凝固処理が必要であるか、分離された血清/血漿を直接提供する必要がある。

• RNA/DNA：濃度>50 ng/μL、総量>1μg、ドライアイス輸送。

• 提供内容：完全な実験報告（実験手順、試薬情報を含む）、生データファイル（.eds/.xls）、データ分析結果グラフ（Excel統計表及び高精細画像）。