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メール
aoxuelg@vip.163.com
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電話番号
13601697841
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アドレス
上海閘北区恒豊路218号現代交通ビル1606室
英国応用光物理会社上海代表処
概要
高フラックス蛋白質安定性分析DSFは多種の分析方法を提供し、比法のほか、SUPR-DSFはBCM（Barycentric mean、重心平均値法）を提供し、350/330比法より良い信号対雑音比を得ることができ、同時に低濃度蛋白質サンプルの分析に有利である。
製品詳細
蛋白質安定性
蛋白質の安定性は生物技術薬物の重要な重要な品質属性の1つであり、それは生物薬物の薬効、生産の実行可能性、安全性と賞味期限を決定した。タンパク質の高度な構造安定性は、タンパク質がその棚の寿命期間中に活性と安全を維持することを確保する。
安定性研究は、温度、pH値、添加剤成分、貯蔵時間などの異なる条件下での蛋白質の高級構造HOS（High Order Structure）の安定性を確認し、適切な貯蔵と輸送条件を決定するために使用される。同時に、FDA、EMAなどの規制機関は、承認を受ける前にも広範な安定性データを要求している。そのため、治療性蛋白質薬物の高級構造安定性を理解し、確保することは生物製薬企業が安全で有効な薬物を開発する必要条件であり、研究者は研究開発と生産の複数の段階で蛋白質の高級構造安定性に対して分析と評価を行う必要がある。
蛋白質安定性の一般的な分析方法
蛋白質の安定性分析は通常、以下の方法を用いて研究される。
生化学的方法
円二色スペクトル（CD，Circular Dichroism Spectroscopy）
示差走査熱量測定（DSC）
定量PCR（qPCR）技術（外因蛍光DSF）
動的光散乱（DLS）と静的光散乱（SLS）方法
示差走査熱量測定（DSC）法はしばしば蛋白質安定性分析の最も重要な解決策として用いられるが、96または384ウェルプレートなどのミクロウェルプレート上に貯蔵された大量のサンプルの迅速な分析ニーズのため、薬物スクリーニングおよび早期開発におけるDSCの応用は一定の制限を受けている。そのため、DSF（内因性蛍光法）は流行しており、コスト効果のあるソリューションとなっている。
DSF（内因性蛍光法）は測定試料に対していかなる標識を行う必要はなく、いかなる蛍光プローブを使用する必要もなく、すぐに全体の試料微孔板を測定することができ、そして高フラックスデータを提供して試料候補物と配合成分のスクリーニングを支援する。
DSF法は大量のサンプルを迅速にスクリーニングし、薬物スクリーニング、薬剤形成分析の効率を大幅に高め、分析結果とDSC技術は互いに直交して検証した。多くのバイオテクノロジー薬物にとって、DSF法を用いて迅速かつ大量のスクリーニングを行い、DSC技術を用いてDSFの早期スクリーニング結果を直交的に検証することは、薬物スクリーニングと薬物開発の有効な方案である。
DSF技術原理：
示差走査蛍光法（DSF）は、温度上昇または変性剤の存在時の蛍光発光スペクトルの対応する変化を検出することによってタンパク質の変性転移温度（熱転移温度Tm値または化学変性Cm値）を決定する、経済的で効率的で使いやすい生物物理技術である。
研究により、蛋白質分子中の芳香環アミノ酸は異なる極性の微小環境（疎水環境や親水環境など）にある場合、励起された内因性蛍光の最大発光スペクトルが変位することが分かった。タンパク質中の内因性蛍光は、トリプトファン（Trp）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）などの芳香環含有アミノ酸に主に由来し、トリプトファン内因性蛍光が強い。
ロイシンを例にとると、タンパク質疎水性コア微小環境では、その内因性蛍光の最大発光波長は330 nm前後であるが、親水性の極性微小環境では、ロイシンの内因性蛍光の最大発光波長は350 nm前後である。タンパク質の熱変性または化学変性は、通常、タンパク質疎水性コアに埋め込まれているトリプトファンが親水性環境に徐々に暴露されるように、トリプトファン残基周辺の微小環境の極性を変化させ、それによって内因性蛍光の最大発光波長が赤方偏移（Red Shift）し、すなわちより大きな波長領域に移動することをもたらす。
このようなロイシン内因性蛍光変化を監視する方法は蛍光プローブやラベルを必要とせず、従来の外因性蛍光DSFにおける背景蛍光や非特異吸着などの偽陽性結果を回避する。
蛋白質が熱変性または化学変性剤（例えば塩酸グアニジン、尿素など）の作用により収縮した場合、温度または変性剤に伴う内因性蛍光の変化を測定することで蛋白質の展開過程を研究することができる。これらの変化のデータを用いて溶解曲線を生成し、見かけの熱転移温度Tm値、Tonset、ファンデルワールスエンタルピー変化（ΔH）、ギブス自由エネルギー（ΔG）、化学変性Cm値などは蛋白質安定性の評価と予測に用いられる。
従来のDSFは常に350/330比法を用いてデータ分析を行っているが、SUPR-DSFは複数の分析方法を提供しており、比法のほか、SUPR-DSFはBCM（Barycentric mean、重心平均法）を提供しており、350/330比法よりも良い信号対雑音比を得ることができ、同時に低濃度タンパク質サンプルの分析に有利である。
高スループット蛋白質安定性分析DSFシステムの主な特徴：
標準的な384マイクロウェルプレートを採用し、特別な消耗品や毛細管を必要としない
高フラックススクリーニングは、昇温プロセス（60〜80分）内に完了することができる
単一ブロック384微多孔板の試験は内因性蛍光を利用し、染料やラベルを必要とせず、常用生物系UV LED励起と全スペクトル検出を両立する
10-30μlサンプルのみが必要で、サンプル濃度は0.05 ~ 250 mg/mL
重要なパラメータを得る：Tonset、Tm、ΔΗ、ΔG、Cm及び親和性など
厳格なデータ品質と再現性を提供
SUPR-DSFシステムの応用：
SUPR-DSFシステムは生命科学基礎研究や薬物開発など多くの分野に広く応用されている：
加速変異体のスクリーニング
フォーミュラと事前フォーミュラのフィルタリングと最適化
タンパク質結晶化条件スクリーニング
バッチ間一貫性評価
生物類似性評価
加速応力と強制分解の研究
結合誘起立体配座変化解析
翻訳後修飾評価
恒温及び化学安定性解析
高スループット蛋白質安定性解析DSFシステムの技術仕様：
典型的な応用例：加速変異体のスクリーニング
16個のサンプルを、野生型タンパク質（WT）1個と単一点変異体15個を含むSUPR−DSFを用いて比較し、スクリーニングした。1.5時間以内に、DSF計器は48個のサンプル（1群3回繰り返し）の高品質融解曲線（同時間に最大384ウェルのデータを生成できる）を生成した。モデルを用いてデータをフィッティングし、溶解温度Tm値を取得し、安定性をソートし、スクリーニングすることができる。
図1に示すように、3つの変異体（9、13、14）の融解曲線がWT（青色）に比べて左にシフトし、蛋白安定性が低下していることを示している。残りの12個の変異体の安定性はいずれも向上した。このうち、変異体1、8、12の安定性向上が最も大きかった。
図2はいくつかの代表的なサンプルの溶解曲線を示しており、いくつかのタンパク質は単一の熱転移過程（WTタンパク質と変異体7と8）を発生し、他のタンパク質（変異体1と14）は2つの熱転移過程、すなわち溶解曲線に2つの変曲点があることを明らかに示している。SUPR-DSFが提供するデータにより、研究者が将来性のある候補物を選別して深く研究するのに役立つ。
単抵抗のFab領域を正確に解析する
SUPR−DSFを用いてNISTmAb（NISTモノリアクタンス規格品）の差動走査蛍光データを取得し、その結果を差動走査熱量測定（DSC）で得られたデータと比較した。SUPR-DSFはNISTmAbが所有する3つのドメイン：CH 2（69°C）、CH 3（83°C）、Fab領域（94°C）を解析することができる。SUPR-DSFの最高走査温度は105°Cであり、異常に安定したFab領域溶解温度を正確に測定することができるが、他のDSFプラットフォームの走査最高温度は一般的に95°Cであり、単抗Fab領域の収縮変性に関する重要な情報を失いやすい（図5（a））。
SUPR−DSFを正規化したデータをDSC結果と比較した。図5（b）に示すように、3つのピークは互いに整合しており、2つの技術の良好な一致性を証明しており、SUPR-DSFを使用すると高品質のタンパク質安定性情報を容易に得ることができる。
典型的な応用例：トルドービーズ単抗を加速する添加剤と処方スクリーニング
抗体などの生物治療薬の処方は薬効、生産の可能性と安全性を保証する基礎であり、貯蔵と輸送の条件も決定した。製薬企業は、最適な処方を決定するために、大量の条件の組み合わせを迅速かつ信頼性の高い方法でスクリーニングする必要があります。
SUPR-DSFを用いて、研究者は96種類の異なる条件下での治療抗体トラクトールビーズ単抗の安定性をスクリーニングし分析し、1.5時間以内に試験を完成した。試験結果は示差走査熱量測定（DSC）の結果とよく一致した。ラボ自動化装置を統合すれば、1日に数千個のサンプルのスクリーニングを完了することができます。
DSF溶解曲線は2つの独立した遷移領域を示し、最小二乗法によりデータをフィッティングし、Tonset値、Tm値とvanderWaaleエンタルピー変化（△H）を確定することができる。図3（a、b）はそれぞれ安定性を破壊・増強する添加剤の溶解曲線とフィッティング図を示している。図4（a）は、抗体の安定性を高めることができるすべての添加剤（対照試料と比較）を示す。
SUPR−DSFは、市販されているクトゥルフビーズ単抗に使用される添加剤ヒスチジンとトレハロースの安定性作用を正確に鑑別し、図4（b）に示すように、SUPRDSFデータは優れた信頼性と一致性を持ち、同時に驚くべき高スループットを提供する。
高フラックス差走査蛍光法を用いた結合パラメータの取得
結合分析研究は薬物開発の重要な分野であり、相互作用の特徴とKD値（解離平衡定数、分子間結合の親和性を特徴づける）による候補物の選択は極めて重要であり、研究者は多様な原理相補的方法を用いて文庫中の数千種類から数万種類の小分子化合物をスクリーニングし、確定する必要がある。
SUPR-DSFによる分子相互作用分析は、表面効果、物質移動（mass transport）または緩衝液の屈折率問題などの要素の影響を受けず、分析物結合濃度範囲内で高フラックス、標識不要の測定を提供することができる。
タンパク質−リガンド複合体の安定性変化を検出することにより、結合の特異性を確認するために使用することができ、KD値は、熱変性時の蛍光発光スペクトルの変化と配位子濃度の関数的関係から計算することができる。非常に弱い結合分子であっても、結合によって誘起される安定性変化はSUPR−DSFによって検出される。
標準384微多孔板を用いて、1日に数千個のサンプルの安定性をスクリーニングし、結合状態を確認することができる。
SUPR−DSFを用いてリガンド（TFMSA）とヒト無水炭酸酵素Iの結合作用を研究し、TFMSA濃度に伴う炭酸無水酵素の溶解曲線を図6に示す。
図7は、ヒト無水炭酸酵素IのTm値とTFMSA濃度の関係を示し、フィッティングにより得られたKD値は2.1μMと174.2μMの2つであり、
文献中の数値は一致しており、SUPR−DSFはリガンド結合研究のためのプレスクリーニングまたは確認ツールとして使用でき、感度があることが証明されている。
直感的で簡明なソフトウェア
SUPR-DSFソフトウェアは直感的、簡潔、インテリジェント、効率的な実験設計とデータ分析機能を提供し、初心者を迅速に向上させることができ、経験豊富なベテランユーザーに多種のステップアップオプションを提供することができる。
ProteinStableについて
Applied Photophysicsの子会社であり、顧客を中心とした技術をタンパク質スクリーニングと特性化市場に導入することを目的とし、高フラックス、低サンプル量のタンパク質特性化方法に重点を置き、データ品質に影響を与えない条件下で生産性を向上させる。
AppliedPhotophysicsについて
英国の応用光物理会社Applied Photophysicsは数十年来、生物薬の構造と機能研究のために専門的な方案を提供し、製品は円二色CD分光器、停流stopped flow反応動力学分析器、SUPR DSF蛋白質安定性分析器を含む
などがあります。ユーザーは大学や科学研究機関、世界中の製薬会社に広がっている。
Chirascanシリーズの円二色CD分光計は、蛋白質などの生物薬の高級構造特徴、蛋白質などの二級構造、三級構造分析、及び二級構造の熱安定性、三級構造の熱安定性研究を含む。
