草魚肝臓細胞、L8824

製品名称：草魚肝臓細胞、L8824

製品カテゴリ：その他の細胞系

成長特性：壁貼り成長

培養系：DMEM（高糖類）＋10%FBS、28°または21°培養

継代方法：1：2継代

凍結保存条件：無血清細胞凍結保存液

保存条件：＞85%

仕様：1×10 ^ 6 cells/T 25培養ボトル

品番：CS-C 2900

細胞を凍結保存する方法：
冷凍保存方法1：冷凍管を4℃30 ~ 60分（-20℃30分*）-80℃16 ~ 18時間（または一晩おき）液体窒素槽vaporphaseに長期保存する。
冷凍保存方法2：冷凍管を設定したプログラム可能な降温機に置き、毎分1〜3℃から–80℃以下に下げ、更に液体窒素槽vapor phaseに入れて長期保存する。*-20℃は1時間を超えてはいけなくて、氷の結晶が大きすぎて、細胞が大量に死亡することを防止して、またこのステップをスキップして直接-80℃の冷蔵庫の中に入れることができて、ただ生存率は少し下げます。

表皮組織は胚胎時期外胚層から形成され、摩擦抵抗と損傷抵抗の作用がある。会社の科学技術は新鮮または冷凍ラット胎児表皮組織中の高品質の総RNA、PCR準備のcDNA鎖、蛋白質及びそのサブ成分から提供する。すべての製品は出荷前に厳しいQA/QCプロセスを経て品質を確保しています。これらの製品は遺伝子クローン、発現スペクトル分析、および各種分子生物学実験の研究に直接使用することができる。
総RNA調製：Qiagen RNeasy KitのTrizol試薬を用いてRNAを分離し、その後Qiagen RNA Clean Kitを用いて精製した。会社が提供した総RNAサンプルには、RNAサンプルの総濃度、総含有量、電気泳動写真、OD値測定結果などが添付されている。

cDNA調製：精製後の総RNAはcDNA鎖を合成し、MMLV逆転写酵素とランダムプライマー、および総RNA 10 mgを含む50 ul総反応系で逆転写した。68℃で10分間反応した後、RT反応を終了した。1 xRT Bufferを用いてcDNAを輸送し、1 ul cDNAは十分にPCR反応を行うことができる。すべてのcDNA製品は注文出荷前に厳格なQA/QC分析を経て、製品の品質を保証した。

タンパク質の調製：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)ラット胎児表皮組織分解液を調製し、遠心分離して組織破片を除去し、Bio-Rad蛋白検査キットにより蛋白濃度を測定し、組織蛋白を希釈した後、非還元蛋白Buffer（50 mM Tris-HCl、pH 6.8、5%Glycerol、1%SDS、0.002%Bromphenol Blue）に5%β-メルカプトエタノール及びPMSFを添加し、-80度保存した。

潜在的な応用： ＜1＞既知遺伝子のPCRクローン、＜2＞mRNA選択的スプライシング、＜3＞遺伝子クローンと標的配列決定、<4>Western and Northern Blot；＜5＞タンパク質検出とタンパク質群学、＜6＞チップ研究と発現パターン。

細胞処理：

1）蘇生細胞：1 mLの細胞懸濁液を含む凍結保存管を迅速に37℃の水浴（水面は凍結保存管の蓋部より低い）に入れて揺動解凍し、事前に準備した4 mL培地を含む15 mlの遠心管に移して均一に混合する。1000 RPM条件下で4分間遠心分離し、上清を捨て、1 mL培地を加えた後、均等に吹き付けた。その後、すべての細胞懸濁液を5 mlの培地を含む培養瓶に移して一晩培養した。翌日に液を交換し、細胞密度を検査した。
2）細胞継代：細胞密度が80〜90%に達すると、継代培養を行うことができる。
懸濁細胞の場合、継代は以下の方法を参照することができる：
方法1：細胞を収集し、1000 RPM、常温条件下で5分間遠心分離し、上澄み液を捨て、1-2 mLの培養液を補充した後、均等に吹き、細胞懸濁液を1：2から1：5の割合で8 ml培地を含む新しい皿または瓶に分けた。
方法2：半数の液交換方法を選択し、半数の培地を捨てた後、残りの細胞を懸濁し、細胞懸濁液を1：2〜1：3の割合で新しい8 ml培地を含む新しい皿または瓶に分けることができる。
3）細胞凍結保存：細胞成長状態が良好な場合、細胞凍結保存を行うことができる。懸濁細胞を凍結保存する場合、細胞を収集し、1000 RPM、常温条件下で5分間遠心分離し、上澄み液を少量保存し（細胞の吸引を防止する）、新鮮な培地の一部を添加し、均一に吹き付けた後、凍結保存管に添加し、凍結保存管に10%DMSOを加えて均一に振った後、凍結保存を行う。凍結保存培地
細胞を凍結保存する際には、推奨される凍結保存培地を使用しなければならない。凍結保存培地にはDMSOやグリセリンなどの凍結保護剤が含まれるべきである。専用に調製された*凍結保存培地も使用することができる。
1）細胞凍結保存培地は哺乳動物細胞のための即用型*凍結保存培地であり、その含有する胎牛血清と牛血清の割合が最適化され、細胞活力及び解凍後の細胞回復効果を改善することができる。
2）凍結保存培地は化学成分で確定された、無蛋白、無菌凍結保存培地であり、10%DMSOを含み、多種の幹細胞と初代細胞（メラニン細胞を除く）の凍結保存に適している。
操作の流れ：
1.1主要試薬と器具：逆位相差顕微鏡（日本olympus imt-413）、co 2インキュベーションタンク（日本yamato it-61）。
1.2 hek-293細胞の蘇生培養継代及び凍結保存：
1.2.1細胞の蘇生培養液は液体窒素タンクから凍結貯蔵管を取り出し、直ちに37℃の水浴に投入し、絶えず揺動し、急速に溶解させる。溶解した細胞凍結貯留管を取り出し、アルコール消毒した後に開き、細胞が溶解した凍結貯留液を吸引し、事前に培養液（37℃で予熱し、8〜10倍体積）を入れて遠心管内に入れ、少し吹き付けて混合し、その後1000 rpm 5 min、上清を除去し、適量の培養液を加え、細胞懸濁液に吹き付け、1×105／ml密度で25 cm 2培養瓶に接種し、37℃、5%co 2及び飽和湿度で培養した。
1.2.2細胞継代原代培養のhek−293細胞48 hを1回交換し、細胞長が60%〜70%になって融合した時、0.25%で1〜2 min消化し、培養瓶を更に手のひらで軽くたたいて細胞を脱壁、懸濁、分散させ、細胞を更に分散させるためにブロー管で軽く数回ブローし、細胞懸濁液を得て、それから倍量の培地を添加し、穏やかに混合し、ストローで混合液を分注し、継代で細胞を増幅する。
1.3細胞形態の観察逆さま顕微鏡下で細胞の成長状況及び形態特徴を観察し記録する。
1.4細胞の計数常規消化細胞、細胞が丸くなり、壁を脱いで浮上し、少量の培地を加えて遠心分離し、再びpbsで再懸濁し、吹きつけて細胞懸濁液にする。細胞計数板カバーガラスの片側に微量の細胞懸濁液を加え、10×対物レンズで計数板四角大格子細胞数を観察し、式に従って細胞数を算出した。細胞数／ml原液＝（正方格子細胞数の和／4）×104。
1.5細胞の壁貼り率指数成長期の細胞は、0.25%で単細胞懸濁液に消化し、計数後、それぞれ12個の25 cm 2培養瓶に接種し、2時間ごとにランダムに3本の細胞を取り出し、培地及び壁貼り細胞を吸引除去し、膵臓消化酵素を加えて壁貼り付け細胞を消化、計数し、その平均値を取り、式：壁貼り率（%）＝（壁貼り付け細胞数/接種細胞数）×100%に基づいて、壁貼り率を計算した。
1.6クランク線取指数成長期を成長させた細胞は消化を用いて単細胞懸濁液を作製し、1×104/ウェルで24ウェルプレートに播種し、1ウェル当たり1 mlの培地を添加した。毎日ランダムに3ウェルを採取し、1ウェル当たりの細胞数を数え、平均値を計算した。10 d連続カウントし、細胞成長曲線を描画した。

以下に関連する製品を示します。

EstradiolBenzoateフェニレンエストラジオール牛口蹄疫抗体検出試験箱

Acifluorfeneトリフルオロカルボキシオキサイド羊口蹄疫抗体検出試験箱

D-Ribose D-リボース1、2、3-トリ[（シス、シス）-9、12-オクタデセンアシル]グリセロールエステル

Oleanolic acidピグメント17β-ヒドロキシ-4-雄エン-3-17-エステル
草魚肝臓細胞、L8824ヒトリパーゼA 2 elisa試験箱≧4190%as determined by SDS-PAGE 2,5-ジパラフェニ二

ヒトグルコース変位酵素elisa試験箱≧4191%as determined by SDS-PAGE 4-クロロ-6-イル-5-フルオロピリミジン

ヒトイノシトール3キナーゼelisa試験箱≧4192%as determined by SDS-PAGE L-（+）-扁桃エステル

ヒト化アデノシン活性化タンパク質キナーゼelisa試験箱≧4194%as determined by SDS-PAGE N，N'-（4，4'-イキレンジフェニル）ビスマレイミド

ヒト化細胞外シグナル調節キナーゼelisa試験箱≧4195%as determined by SDS-PAGEオルトトリフルオロベンゼン

ヒト化核因子κB阻害蛋白質αelisa試験箱≧4196%as determined by SDS-PAGEジイルジアミノ亜鉛

ヒト化蛋白質キナーゼC elisa試験箱≧4197%as determined by SDS-PAGE 2,4,5-トリルチアゾール

ヒトフルクトースキナーゼelisa試験箱≧4198%as determined by SDS-PAGE 6-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホンナトリウム

ヒトグリセロール変位酵素2 elisa試験箱≧4199%as determined by SDS-PAGE 4-フルオロ-3-イルベンズアルデヒド

ヒトリンパサイトカインelisa試験箱≧4200%as determined by SDS-PAGE 2,3-ジピリジン

ヒトリンパ球ケモカインelisa試験箱≧4201%as determined by SDS-PAGE基3-エステル

ヒトリンパ球抗原6複合体遺伝子座A elisa試験箱≧4202%as determined by SDS-PAGE L-バリンアミン第三エステル塩

ヒトリンパ球機能関連抗原3 elisa試験箱≧4203%as determined by SDS-PAGE 3、4、5-トリフルオロベンゾニトリル

ヒトリンパ球機能関連抗原2 elisa試験箱≧4204%as determined by SDS-PAGE 4-イルフェニルボロン

実験報告：
一、分離と育成：
1、無菌条件下で、1-3 d齢SDラット心房組織を取り出し、その後PBSでこの組織塊を2回洗浄し、その後1 mm 3程度の大きさになる;
2、組織塊に4 mLの酵素消化液（0.1%0.1%I型コラーゲン）を添加し、10 s懸濁し、37℃の条件下で10 min消化し、その後スポイトで吹き付けて単細胞懸濁液を作成し、自然沈殿して上清を収集し、10%FBS含有培地で消化を終了した後、4℃で放置する。
3、残りの組織はさらに3～4 mLの酵素消化液を加え、10 s懸濁し、37℃で10分間消化した後、上述の方法で上澄みを収集し、消化を終了した後、4℃で放置し、このステップを2-3回繰り返し、組織*が消化されるまで、
4、200目ステンレススクリーンで細胞消化液を濾過し、1200 r/minで10 min遠心分離し、上清を捨て、沈殿細胞を10%FBS DMEM/F 12含有培地で混合懸濁し、25 cm 2培養瓶に接種し、37℃、5%CO 2培養箱に放置して培養する。
5、差速壁貼付1 h後、培地を吸引し、実験の必要に応じて6ウェルプレートに接種して培養を継続する、
二、免疫蛍光鑑定：
1、心房筋細胞の成長を80%融合まで待っている時、培地を捨て、培養したPBSで細胞を2回洗浄し、毎回10分間、その後4%パラホルムアルデヒドで室温条件下で細胞を15分間固定する、
2、PBSで細胞を2回洗浄し、毎回10分間、その後4℃の条件下で、0.1%TritonX-100で15分間膜を透過した、
3、PBSで細胞を2回洗浄し、毎回10 min、それから室温条件下で、4%BSAで細胞を30 min閉鎖する、
4、α-actin一抗を1：100の割合で希釈し、それを4℃冷蔵庫に入れて細胞を一晩インキュベートする、
5、PBS細胞を3回洗浄し、毎回10 min、1：150の割合で抗α-actinの二抗を希釈し、37℃条件下で1時間放置する、
6、PBSで3回洗浄し、毎回10分後、逆さま蛍光顕微鏡下で画像を観察し、写真を撮る。