クイックワンステップクローニングキット

貯蔵輸送条件

-20℃

製品構成

クイックワンステップクローニングキット

製品紹介

クイックワンステップクローニングキット

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA 片段与线性化载体末端的15~25 nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA 定向克隆技术。

クイックワンステップクローニングキットKitに添加された補助因子は、クローン陽性率を効果的に高める、最適化された反応系は、未精製PCR生成物に含まれる不純物にある程度耐えることができる。アップグレードされたシームレスクローンキットは、陽性率が高く、互換性が高い。

実験手順

クイックワンステップクローニングキット

2.線形化クローンベクターの調製

適切なクローン部位を選択し、ベクターを線形化し、ベクターの線形化は酵素カットまたは逆PCR増幅によって行うことができる。

①酵素切断製造

いくつかの制限的インターロイナーゼは超らせんDNAを効果的に消化できないため、異なる数の未切断ベクターDNAを残し、陽性率を低下させる可能性がある。LightNingTMクイックエンド酵素を用いた酵素カット（モノ酵素カットまたはダブル酵素カット）を推奨し、ベクターを線形化し、転化背景（切断されていないベクター転化により得られる偽陽性クローン）を低減する。

注1：酵素カットによる線形化ベクターは脱リン酸化する必要はなく、ダブル酵素カットを使用することを推奨する。

注2：酵素切断が完了したら、エンドラーゼを失活するか、目的の生成物を精製した後、組換え反応に使用することを提案する。

②リバースPCR増幅調製

増幅突然変異の導入を減らすためには、高忠実度PCR Mixを用いた増幅を推奨する。

注1：PCR生成物に非特異性ストリップがない場合は、Template Eliminator（品番：EG 21203）消化プラスミドテンプレートを用いて再結合反応に使用することを推奨する、逆にPCR生成物を精製して使用することをお勧めします。

注2：マルチフラグメントクローンの場合は、PCR生成物を精製して使用することをお勧めします。

3.挿入フラグメントPCRプライマー設計

PCRプライマーの5'末端は、その隣接する断片（挿入断片または担体）末端と相同である15〜25 nt（推奨18 nt）配列を含む必要がある。担体が粘性末端であり、3'端が突出している場合、プライマー設計は突出部を含む必要がある、5'端部が突出している場合、プライマー設計は突出部を含んでもよく、含まなくてもよい。

フラグメント順方向増幅プライマーを挿入するには：

5'上流ベクター末端相同性配列+酵素カット部位（オプション）+遺伝子特異的順方向増幅配列3'

3'遺伝子特異的逆増幅配列+酵素カット部位（オプション）+下流ベクター末端相同配列5'

注1：できるだけ反復配列がなく、GC含有量が均一な領域を選択してクローンを行い、ベクタークローン部位の上下流25 nt領域内GC含有量が40%~ 60%の場合、再結合が高い、

注2：本キットに提供されるpUC 19ベクター（Ampr）接続端配列は以下の通りである：

4.挿入フラグメントのPCR増幅

増幅突然変異の導入を減らすために、高忠実PCR Mixを用いた増幅を推奨する。精製後のPCR生成物を用いてシームレスクローニング反応を行うことを提案し、もしPCR生成物がアガロースゲル電気泳動により特異的増幅生成物と同定されれば、直接使用することができるが、添加体積は総反応体積の20%を超えてはならない。

5.組換え反応

a.最適担体使用量（ng）＝0.02×担体塩基対数、すなわち0.03 pmol。

b.単一断片を挿入し、最適断片使用量（ng）＝0.04×断片塩基対数、断片当たりzui適用量（ng）＝0.02×断片塩基対数の多断片を挿入する。

注1：挿入された単一セグメントの長さがキャリアより大きい場合は、キャリアと挿入セグメントの使用量を交換する必要があります。

注2：挿入フラグメントの長さが200 bp未満の場合、挿入フラグメントは5倍のキャリア使用量を使用しなければならない。

注3：上記式で計算した使用量がzuidiを超える場合/最高値の場合は、直接最も/最高使用量使用、

再結合反応系の調製が完了した後、ピペット銃で各成分を軽く吸引混合し、気泡の発生を避け、決して渦をかけないようにする。

②反応系を50℃に置き、5 ~ 60 min反応させた。

注1：PCR計などの温度制御が比較的正確な機器を使用して反応することを推奨し、反応時間が不足したり、長すぎるとクローン効率が低下したり、

注2：1〜2個の断片を挿入した場合、推奨反応時間は5〜15 min、3 ~ 5個の断片を挿入する場合、推奨反応時間は15 ~ 30 min、

注3：担体骨格が10 kb以上または挿入断片が4 kb以上の場合、反応時間を30 ~ 60 minに延長することを提案する、

注4：50℃で反応が完了したら、瞬時遠心分離を行い、反応液を管底に集めることを提案する。

③反応液遠心管を氷の上で冷却した後、転化または−20℃に貯蔵する。

注1：−20℃で貯蔵された組換え産物は、1週間以内に使用することを推奨する。

5 ~ 10μlの反応液を採取し、100μlの感受性細胞に添加し、ゆっくりと吸引混合し、氷の上に30分間放置した。42℃で45 ~ 60 sec、氷浴で5 min加熱した。500μlのSOCまたはLB培地を加え、37℃で40 ~ 60 min（200 rpm）振動培養した。菌液を対応する抗生物質を含む平板上に均一に塗布し、37℃で一晩培養した。

注1：異なる感受性細胞の最後のクローン陽性率に差があり、転化効率>108 CFU/μgの感受性細胞の使用を推奨する、

注2：コロニー数はPCR生成物と線形化担体の数と純度に依存する、

注3：陽性対照プレートは通常大量の白色単コロニーを成長させ、陰性対照プレートはわずかなコロニーしか成長させない。

7.陽性クローン検査

単コロニーを10μlのddH 2 Oに選んで混合し、95℃で10分間分解した後、1μlの分解液をテンプレートとして取り、コロニーPCR鑑定を行い、或いは単コロニーを耐性培地に接種して一晩培養した後、プラスミドを抽出して酵素切断鑑定を行った。

注1：コロニーPCRの場合、少なくとも1本の汎用プライマーを使用し、偽陽性結果を避けることを提案する、

注2：必要に応じて、陽性結果をさらにシーケンシング鑑定することができる。

注3：M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：caggaacaggategac

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