ウシ血管内皮細胞増殖因子（VEGF）ELISAキット

ウシ血管内皮細胞増殖因子（VEGF）ELISAキット

保存条件及び有効期間

1.キット保存：2〜8℃

2.有効期間：6ヶ月

じっけんげんり

本キットは二重抗体サンドイッチ法を用いて標本中の牛血管内皮細胞成長因子（VEGF）レベルを測定した。精製したウシ血管内皮細胞成長因子（VEGF）抗体で微孔板を被覆し、固相抗体を作製し、単抗を被覆した微孔に血管内皮細胞成長因子（VEGF）を順次添加し、HRP標識血管内皮細胞成長因子（VEGF）抗体と結合し、抗体−抗原−酵素標識抗体複合体を形成し、徹−底洗浄後に基質TMBを添加して発色させた。TMBはHRP酵素の触媒下で青色に変換され、酸の作用下で最終的な黄色に変換される。色の濃淡は試料中の血管内皮細胞増殖因子（VEGF）と正の相関を示した。酵素スケールを用いて450 nm波長で吸光度（OD値）を測定し、標準曲線を用いてサンプル中のウシ血管内皮細胞増殖因子（VEGF）濃度を計算した。

キット組成

130倍濃縮洗浄液20 ml×1本7ていしえき6 ml×1本

2酵素標準剤6 ml×1本8標準品（3200 pg/ml）0.5 ml×1本

3酵素標準被覆板12穴×8本9標準品希釈液1.5 ml×1本

4サンプル希釈液6 ml×1本10取扱説明書1部

5発色剤A液6 ml×1本11シーリングフィルム2枚

6発色剤B液6 ml×1/本12シール袋1つ

操作手順

1.標準品の希釈：本キットは原倍標準品1本を提供し、ユーザーは以下の図表に従って小試験管の中で希釈することができる。

1600ピコ/ミリリットル5号標準品150μlの原倍標準品に150μl標準品希釈液を添加

800ピコ/ミリリットル4号標準品150μlの5号標準品に150μl標準品希釈液を添加

400ピコ/ミリリットル3号標準品150μlの4号標準品に150μl標準品希釈液を添加

200ピコ/ミリリットル2号標準品150μlの3号標準品に150μl標準品希釈液を添加

100ピコ/ミリリットル1号標準品

2.試料添加：それぞれ空白孔（空白対照孔に試料及び酵素標準試薬を添加せず、残りの各工程の操作は同じ）、標準孔、測定対象試料孔を設置する。酵素標識被覆プレートに標準品を正確に50μl添加し、測定試料孔に試料希釈液40μlを添加した後、測定試料10μlを添加した（試料の最終希釈度は5倍）。サンプリングしてサンプルを酵素スケールプレートの穴の底に加え、できるだけ穴の壁に触れないようにして、軽く揺れて混ぜます。

3.温育：封板膜で封板した後、37℃で30分間温育した。

4.配液：30倍濃縮洗浄液を蒸留水で30倍希釈した予備用

5.洗浄：封板膜を慎重にはがし、液体を捨て、乾燥させ、穴ごとに洗浄液を満タンにし、30秒静置して廃棄し、このように5回繰り返し、乾燥させた。

6.酵素添加：酵素標的試薬を穴ごとに50μl添加し、空白穴を除く。

7.

8.洗浄：操作は同5。

9.発色：孔ごとに発色剤A 50μlを添加、更に発色剤B 50μlを添加し、軽く振動混合し、37℃で光を避けて10分間発色.

10.終了：1ウェル当たり終止液50μlを添加し、反応を終了する（この時、青色は黄色に立転する）。

11.測定：空白孔をゼロに調整し、450 nm波長を順に各孔の吸光度（OD値）を測定する。測定は終止液添加後15分以内に行う。

計算

標準物の濃度を横座標、OD値を縦座標とし、座標紙に標準曲線を描き、サンプルのOD値に基づいて標準曲線から相応の濃度を検出する、希釈倍数を乗算する、あるいは標準物の濃度とOD値を用いて標準曲線の直線回帰方程式を計算し、サンプルのOD値を方程式に代入し、サンプル濃度を計算し、希釈倍数を乗じること、すなわちサンプルの実際の濃度である。

注意事項

2.濃洗浄液は結晶析出する可能性があり、希釈時に水浴中で加温して溶解を助けることができ、洗浄時に結果に影響しない。

3.各ステップのサンプリングはサンプリング器を使用し、試験誤差を避けるために常に正確性を校正しなければならない。1回のサンプリング時間は5分以内に抑えることが好ましく、例えば標本数が多い場合は、排銃によるサンプリングを推奨する。

4.毎回測定しながら標準曲線を作ってください。復孔をしたほうがいいです。サンプル中の測定対象物質の含有量が高すぎる（サンプルOD値が標準品穴の第1穴のOD値より大きい）場合は、まずサンプル希釈液で一定倍数（n倍）希釈してから測定し、計算時に最後に総希釈倍数（×n×5）を乗じてください。

5.基板封止フィルムは、交差汚染を避けるために使い捨てに限られている。

6.基質は光を避けて保存してください。

7.厳格に説明書の操作に従って行い、試験結果の判定は酵素標準器の示度を基準としなければならない。

8.すべてのサンプル、洗浄液及び各種廃棄物は伝染物によって処理しなければならない。

9．ウシ血管内皮細胞増殖因子（VEGF）ELISAキット異なるロット番号成分は混用してはならない。