せいぶつしやく

一、マイコプラズマ検出キット

（1）培養細胞上清液1μlと水浴釜1台だけで、ゲノムDNAを抽出する必要がなく、蛍光顕微鏡、PCR器、電気泳動器、ゲルイメージャ、生物発光検出器などの複雑な実験設備が不要である、

（2）わずか1 hで結果を出し、簡単で迅速で敏感な細胞マイコプラズマ検出方法、

（3）1ステップで全体の実験を完了し、実験結果は反応液の色変化に基づいて肉眼で直感的に判別しやすく、電気泳動を必要とせず、複数ステップで蓋を開けることによる偽陽性リスクを回避する、

（4）感度はPCR法よりはるかに高く、細胞培養中によく見られる多種のマイコプラズマ（ブタ鼻マイコプラズマ、ジグリンマイコプラズマ、口腔マイコプラズマ、レグレスコレステリック原体、発酵マイコプラズマ、唾液マイコプラズマ、ヒト型マイコプラズマ、ナシマイコプラズマを測定でき、マイコプラズマ汚染の98%を占める）を測定できる。

二、マイコプラズマ検出キット

三、実験手順：

（1）測定対象細胞培養液上清準備

測定対象細胞は2〜3日培養し、溶解度が80%以上に達した場合、細胞培養液200μL以上の体積を採取し、200 gで5分間遠心分離し、その後清液を採取して後続検査を行った（管底部50μl培養液及び細胞沈殿を採取しなければよい）、

（2）反応系の調製（まず溶液A、溶液B、陽性対照、パラフィン油を解凍溶解した後直ちに氷上に置く）

溶液Aを−20℃から取り出し、解凍して溶かした後、上下を軽く逆さまにして混ぜる。測定すべき細胞サンプル数に基づいて微量遠心管中に以下の反応系を調製した（反応系調製過程は氷上で行うことが非常に重要である）、

備考：毎回の実験には1つの陰性対照、1つの陽性対照が必要であり、ピペットにはピペット誤差があるため、N個のサンプルを検査するのは一般的にN+3個の上記反応系を調製することを推薦する

振動器で軽く混合し、その後PCR管に分注し（200μl体積PCR管の使用を推奨）、各管に24μlの上記混合後の反応液を分注し、

（3）サンプルアップ（サンプルアッププロセス全体を氷の上で維持することは非常に重要であり、特に反応液の上に被覆されたパラフィン油は氷の上で予冷する必要がある）

測定対象試料：反応管に1μlの測定対象遠心分離後の培養液上清を添加し、その後この液添加銃で上下に移動して軽く5回吹き付け、

陰性対照：任意のサンプルを添加しない、または無菌水1μlを添加する、

陽性対照：1μlの陽性対照サンプルを添加し、その後この液体添加銃で上下に移動して5回軽く吹き付けた、

次いで、各反応管溶液の上に25μlのパラフィン油（水浴釜で反応）を軽く加えて、液体の蒸発による結果の不正確さを防止した。パラフィン油を添加する際は、試料間の交差汚染を防ぐために銃のヘッドを交換するたびに注意してください。

（4）反応

水浴釜またはPCR計の温度を61℃に設定し、反応管に入れ、60分間インキュベートする。

メモ：

1、水浴鍋の実際の温度は設置温度と偏差がある可能性があり、まず温度計で校正することを提案する。実際には59 ~ 63℃の反応を行うことができますが、検出感度に影響を与えます。

2、反応生成物は蓋を開けてはいけない、そうしないと発生したエアロゾルは後続の検査偽陽性の出現を招く。反応管をビニール袋や手袋に包み、専用ゴミ箱に捨て、速やかに整理することを提案する。

3、オーブンや金属浴を用いた加熱反応はお勧めしません。

（5）結果判断

光の良い環境で反応結果を観察します（白い紙を背景にすることをお勧めします）。反応液が青紫色のままであれば陰性と判定し、反応液が空色であれば陽性と判定される。

四、関連文献

1、何世玉、黄艶芝、趙艶玲。逆転写ポリメラーゼスクリュー反応（RT−PSR）に基づく高速コサチウイルス検出方法及び手足口病の臨床診断における応用。微生物学最前線2020、12(11):734-743.

2、オドリー・ジーン、フローレンス・タディ、オランアラティフ。1.5 kb 16 SrRNA遺伝子断片を得た汎用プライマープライマーを用いてqPCRを行い、細胞培養物のマイコプラズマ汚染を評価した。PLOSONE.2017；12（2）：e0172358。

3、 ZohreSoheily、Mohammad Soleimani、KeivanMajidzadeh Ardebili。ALoop媒介の等温増幅法は細胞培養中のマイコプラズマ汚染を検出する。CellJ.2019；21(1):43-48.

4、新旭、王雪雨、胡文。犬の微細ウイルス感染の迅速診断に用いる改良ポリメラーゼ架橋スクリュー反応測定法。獣医学最前線、2020年、7(57):1629-1636.