2025年4月4日、米カリフォルニア州スクリップス研究所のKendall W.Nettles教授和John R.Yates III教授は共同通信の著者としてnature chemical biology誌に「Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer」と題する記事を発表した、この文は1種を開発しましたNative top-down proteomics（nTDP）ポリシー、乳癌細胞（過発現表皮成長因子受容体（EGFR）の内分泌抵抗モデルを含む）の中で≦70 kDaの蛋白質群複合体を識別するために、共に同定した17種類のタンパク質複合体の104種類のcomplexoforms（タンパク質複合体の特定の組み立て形態）。この研究により、EGFRは核輸送因子2（NUTF 2）組立体の解離を誘導することができ、NUTF 2のK 4とK 55の翻訳後修飾部位はエストロゲン受容体（ER）信号経路の抑制に差異化の影響を与えることが分かった。この研究は乳がん蛋白質群の分子特徴及び腫瘍の成長と治療抵抗におけるcomplexoformsの役割を明らかにし、疾病機序の理解と薬物の開発に新しい視点を提供した。

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一

研究背景

WHO国際がん研究機関が最新発表したデータによると、2020年の世界の乳がんの新発例は226万例に達し、肺がんの220万例を上回った。乳癌はすでに肺癌に取って代わって、世界第一の癌になった。蛋白質は非共有結合相互作用によって機能複合体を組み立て形成し、細胞内に乳癌などの悪性腫瘍に関連するほぼすべての重要な機能を含むように駆動し、蛋白質が差異スプライシング、配列変異、翻訳後修飾（PTMs）または突然変異によって産生される多種のproteoformはこれらの機能複合体の形成、安定性と活性に影響を与える。従来のボトムアップタンパク質群学的方法は、単一タンパク質産生のproteoformの解明、タンパク質複合体と結合するリガンドと補助因子の特性化、および組合せPTMsパターンの描画に限界があった。原形質スペクトル（Native MS）とトップダウン蛋白質群学（Top-down Proteomics）が結合して形成されたNative Top-down Proteomics（nTDP）は構造解析能力があるが、複雑な生物サンプル中の蛋白質複合体の存在度が低く、蛋白質複合体の分離が困難で、大規模なnTDPデータセットを処理する生物情報学ツールが不足しているなどの問題があり、nTDPは現在、主に精製に用いられている蛋白質複合体の分析において、複雑な生物サンプル中の応用が少ない。乳癌研究において、成長因子信号伝導は内分泌治療抵抗の主要な機序の一つであり、表皮成長因子受容体（EGFR）の増幅及び下流信号成分の突然変異は臨床タモキシフェン抵抗と相関があるが、具体的な機序はまだ明確ではない。そのため、乳がん細胞中のタンパク質組立体の特徴を研究し、疾患分子のメカニズムを深く理解し、有効な薬物を設計するための有効な方法が必要であり、これはこの研究の開発とnTDP戦略の応用に背景と動力を提供した。

二（に）

研究方法

1

研究対象：

エストロゲン受容体α（ERα）陽性のMCF−7乳がん細胞（後述するMCF−7細胞）と表皮成長因子受容体（EGFR）を過発現するMCF−7細胞（ER標的治療のための薬剤耐性モデルとして、後述するMCF−7−EGFR細胞）。

2

nTDPワークフロー

研究者が開発したnTDPのワークフローは図1に示すように、まずオフラインnativeサイズ排除クロマトグラフィー（nSEC）を用いて細胞から抽出した可溶性タンパク質複合体を分離し、その後、nano-ESI-FAIMS-MSn（液相：Easy-nLC 1200、気相分離装置：FAIMS、質量分析：Orbitrap Fusion Lumos）蛋白複合体に対してnative top-downの特徴分析を行った、最終利用ProSight ネイティブソフトウェアは手動補正と結合して複雑な質量分析データを解析する。

図1：nTDPワークフロー（クリックして大図を見る）

三

研究結果

1

nTDPワークフロー検証

研究者はまず3つのタンパク質複合体を利用した：carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa)を使用して、nano-ESI-FAIMS-MSnシステムの再現性とロバスト性を検証します。結果：このシステムは安定的に蛋白質複合体を分離、破砕することができ、蛋白質の特徴を有効に解明できる質量分析データを生成することができる（図2-4）。また、FAIMSが気相レベルで70 kDaまでのタンパク質複合体を分離できることも検証した。（図5）

図2：CA IIのnTDPスペクトル図とProSight Liteによる断片化図（クリックして大図を見る）

図3：SAのnTDPスペクトルとProSight Liteによる断片化図（クリックして大図を見る）

図4：AVのnTDPスペクトル図とProSight Liteによる断片化図（クリックして大図を見る）

図5：標準蛋白質複合体の基底ピーク遷移図及びそのCV値

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2

nTDP分析MCF−7と

MCF-7-EGFR細胞抽出物

その後、研究者はnSECシステムを用いて乳癌細胞（MCF-7とMCF-7-EGFR）の細胞抽出物を分離し、nSECスペクトルの結果はMCF-7とMCF-7-EGFR（16回の反復実験）から抽出した蛋白複合体が安定して有効な分離ができることを示した。分離した蛋白複合体をnano-ESI-FAIMS-MSnシステムで測定し、共に測定した17種類のタンパク質複合体の104種類のcomplexoformsタンパク質−金属複合体、タンパク質−タンパク質−金属複合体及びタンパク質−タンパク質複合体を含む。

図6：MCF-7中の蛋白質標識品と蛋白質凝集体のnSECスペクトル図、MCF-7細胞中の蛋白質凝集体接着図、MCF-7-EGFR中の蛋白質標識品と蛋白質凝集体のnSECスペクトル図、MCF-7-EGFR細胞中の蛋白質凝集体接着図。（クリックしてグラフを見る）

3

乳がんに関連する蛋白質複合体のキャラクタリゼーション分析

TPI複合形式：TPIは乳癌に関連する糖酵母分解酵素であり、TPIが薬物耐性、腫瘍進展と転移と関係がある可能性があることを示す研究がある。研究者はMCF-7とMCF-7-EGFR細胞の中でTPI二量体構造を観察し、分子質量は約53 kDa（nSEC-fraction 4）であった。二量体TPI複合体は、切断とリン酸化のモノマータンパク質変異体の組み合わせから形成され、モノマータンパク質変異体上に2つの脱アミド（N 15とN 71）が発生する。研究者はまた突然変異（E 104 D）TPIモノマーから形成されたTPI複合体を発見し、E 104 DモノマーサブユニットのTPIはリン酸化、脱アミド化、アセチル化することができる。

図7：MCF-7細胞抽出物中のTPI complexoforms複合体のnTDPスペクトル（クリックして大図を見る）

•MIF複雑形式：MIFは多種の癌、自己免疫疾患と炎症の中で生物学的相関性を持つ多機能サイトカインであり、研究者はMIFがMCF-7とMCF-7-EGFR細胞の中ですべて高発現することを発見し、native MS 1スペクトルはMIF complexoformsの詳細な情報を提供し、全部で5種類のMIF（相同性と異種）三量体構造を形成した。MS経由nのスペクトル解析により、短く切断された、未修飾の、ニトロソ化とアセチル化のMIFモノマー蛋白質変異体（ニトロソ化とアセチル化はそれぞれC 80とK 77で発生する）が発見された。

図8：MCF-7細胞抽出物中のMIF complexoforms複合体のnTDPスペクトル（クリックして大図を見る）

SOD1複合形態：金属酵素SOD 1は重要な抗酸化剤であり、癌遺伝子によって駆動される乳腺腫瘍の形成及び超酸化物のOへの転化に対して2とH2O型2極めて重要である。研究者はMCF-7とMCF-7-EGFR細胞に分子質量約32 kDaのSOD 1二量体構造を観察し、MS 1スペクトル（11＋電荷状態）とMS 2スペクトル（6＋電荷状態）からSOD 1タンパク質変異体サブユニット中のCuを観察した2+およびZn2+金属イオンの非共有結合、SOD 1タンパク質変異体はまたN末端アセチル化、一対の二硫黄結合（C 57−C 111）及びN−末端メチオニンの切除を有する。

図9：MCF-7細胞抽出物中のSOD 1 complexoforms複合体のnTDPスペクトル（クリックして大図を見る）

NUTF2複合形式：NUTF 2は、小さなGTP酵素Ranの核内輸送を媒介するダイマータンパク質である。研究者はMCF-7とMCF-7-EGFR細胞から8種類の異なるPTM組み合わせのNUTF 2タンパク質変異体を同定し、これらの単量体は26種類の異なるcomplexoforms中に分布した。MS 1スペクトルから、MCF−7−EGFR中の内因性NUTF 2二量体複合体含有量はMCF−7細胞に比べて著しく減少し、3つのアセチル化NUTF 2イソ二量体はMCF−7−EGFR細胞特有であることが分かった。

図10：MCF-7とMCF-7-EGFR細胞抽出物におけるNUTF 2のnTDPスペクトル（クリックしてグラフを見る）

図11：MCF-7とMCF-7-EGFR細胞抽出物中のNUTF 2 complexoformsとproteoformsの強度情報（クリックして大図を見る）

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4

NUTF 2媒介EGFRとERパス間の相互作用

前期のnTDPデータの結果、MCF-7-EGFR細胞中のNUTF 2二量体の数はMCF-7細胞中より著しく低いことが発見され、研究者はNUTF 2を用いて2種類の異なる親和性ラベルと共同沈殿させ、検証したEGFRは核輸送因子2（NUTF 2）二量体解離を誘導できるという結論。NUTF 2の翻訳後修飾（PTM）部位は脊椎動物において保存性があり、NUTF 2蛋白複合体の結晶構造はK 4が核孔蛋白結合部位に近いことを示している。K 55とK 63はRan結合部位に近く、K 55はRanとNUTF 2の間の水媒介接触に関与しているため、研究者はK 4とK 55部位に突然変異を行った。その結果、MCF-7細胞中のNUTF 2の発現は乳癌細胞の成長を抑制し、K 4 Q突然変異はこの抑制を逆転することができ、K 55 R突然変異は抑制を増強するこのことは、PTMサイト（K 4、K 55）が核細孔結合またはRan相互作用に影響することによって細胞成長を調節できることを示している。NUTF 2はエストロゲン誘導増殖遺伝子GREB 1を下方修正し、K 4 Q突然変異は4 OHTなしでこの表現型を回復することができる。これは、異なるPTM部位のNUTF 2 proteoformsが異なる生物学的結果をもたらすことを示している。

図12：NUTF 2はERの信号伝導を調整し、成長を抑制する

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NUTF 2がER信号伝導と4 OHTへの応答をどのように調整するかをさらに研究するために、CUT&RUN技術分析により、MCF-7細胞中のERとNUTF 2の結合部位はほとんど重複していないが、NUTF 2発現と4 OHT処理はERの結合パターンを変えることが分かった。NUTF 2発現は1353部位でのERの結合に差を生じ、4 OHT処理後のMCF−7とMCF−7NUTF2 の細胞のER結合部位は重複もあれば差異もある。しかし、4 OHT感受性NUTF 2部位には132個の共有ER基底準位点（すなわち「1−AGGTCA」）しか発見されておらず、これはNUTF 2が間接機構を通じてER染色質占有率と活性を調節することを示している。NUTF 2の成長抑制の分子機構をより明確に理解するために、研究者はMCF-7とMCF-7 NUTF 2細胞のRNA-seqを完成し、遺伝子集合濃縮分析は600以上の差異発現遺伝子の中に、RNA分解代謝関連遺伝子、NuRD複合体成分（例えばHDAC 1）とアポトーシス遺伝子ERRFI 1、下方ミトコンドリア酸化リン酸化関連遺伝子（例えばBCL 2）と発癌遺伝子（例えばRASファミリー遺伝子）を含むことを表明した。パス富化分析により、これらの遺伝子は多種の癌とEGFR関連パスに関連し、EGFR信号効果因子としてのNUTF 2の役割をサポートすることが明らかになった。ERα−APEX 2近接蛋白質群学的研究によると、NUTF 2発現はJunB標識の増加、腫瘍抑制因子HSPBP 1とCSDE 1標識の減少など、ERの相互作用群を変化させることが明らかになった。NUTF 2：WTとNUTF 2：K 4 Q細胞を比較し、ER相互作用群に差異（例えばCNOT 9標識増加、DNMT 3 A標識減少）が存在し、さらにNUTF 2がER関連蛋白相互作用を制御することによって通路に影響することを確認した。

図13：NUTF 2-ERの相互作用

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四

結論と意義

1

nTDP方法学の成功的な確立と応用

本研究はnTDP workflowを最適化し、オフライン原生サイズ排除クロマトグラフィー（nSEC）、ナノエレクトロスプレーイオン化（nano-ESI）、フィールド非対称イオン移動スペクトル（FAIMS）と多段直列質量分析（MSn）を結合し、乳癌細胞（MCF-7及びMCF-7-EGFR）から17種類の蛋白質複合体の104種類のcomplexoformsを鑑定し、蛋白質-金属複合体、蛋白質-蛋白質-金属複合体、蛋白質-蛋白質複合体などを含み、しかも≦70 kDaの内因性蛋白質集合体を特徴づけることができ、伝統的な方法を克服して複雑な生物サンプル中で低豊潤度蛋白質を分析した質複合体の限界。

2

重要なタンパク質複合体の発見と機能解析

リン酸プロピル糖異性化酵素（TPI）、マクロファージ移動抑制因子（MIF）、超酸化物不均化酵素（SOD 1）のcomplexoformsなどの癌に関連する重要なタンパク質複合体を識別し、その翻訳後修飾（PTMs）部位（TPIの脱アミド、リン酸化、MIFのニトロソ基化、アセチル化、SOD 1の金属結合部位など）及びその複合体の構造と機能に対する影響を明確にした。コア発見：EGFR過発現は核輸送因子2（NUTF 2）二量体解離を誘導する。NUTF 2二量体は核孔シャトルタンパク質としてRANの核入力に関与し、その過発現は乳がん細胞の成長を抑制するが、異なるPTM部位（K 4とK 55）の突然変異はこの抑制効果を逆転または激化させ、NUTF 2のPTMsがエストロゲン受容体（ER）信号経路を調節することによって乳がんの成長に影響を与えることを示している。

3

NUTF 2と乳がん内分泌抵抗との関連機序

NUTF 2は、エストロゲン誘導増殖遺伝子GREB 1を下方修正し、アポトーシス遺伝子ERRFI 1を上方修正するなど、ERのDNA結合とタンパク質相互作用ネットワークを間接的に調整することによってER信号経路に影響を与え、乳がん細胞の成長を抑制する。EGFR過発現（内分泌治療抵抗モデル）はNUTF 2二量体レベルを減少させ、そのPTMsモードを変化させ、ER信号に対するNUTF 2の制御作用異常をもたらし、EGFR媒介のタモキシフェン抵抗の重要なメカニズムの一つである可能性がある。

4

nTDPの分野的意義

この方法は複雑な生物サンプル中の内因性蛋白質複合体の大規模な分析に新しいパラダイムを提供し、脆弱な非共有結合相互作用を保持し、proteoformのPTMs、組立モード及び配位子結合を正確に特徴づけることができ、癌生物学、薬物標的の発見と構造生物学研究に新しい道を開き、特に乳癌治療抵抗の分子メカニズムを理解するために重要な見解を提供した。

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