まえがき

抗体-小分子薬物カップリング（antibody drug conjugates、ADCs）は、治療性生物製品の一種であり、抗体によって標的細胞を精確に識別し、内呑み込み作用によって標的細胞に入った後にカップリングされた小分子薬物を放出し、それによって標的細胞に対する精確な殺滅の目的を実現し、正常細胞に対する殺傷を最大限に減少させることができる。ADCの設計原理により、イメージされるのは「バイオミサイル」に例えられ、2000年に最初のADC薬物Mylotarg® （gemtuzumab ozogamicin）がFDAに承認された後［1］、2025年6月現在、全世界で19のADCが上場承認されている。2023年に世界のADC販売総額が初めて100億ドルを突破した後、2024年に世界のADC販売総額は引き続き100億ドルを超え、力強い成長の勢いを続けている。

2024年の世界ADC販売台数上位10位のADCのうち、2位はロシュ製のKADCYLA（エンメ・トゥトジュ、ヘセレ）だった。この薬は2013年にFDAによってHER 2陽性乳がんの治療に使用されることが承認され、2024年の世界売上高は約23億ドルとなった[2]。エンメクトゥールビーズ単抗は、安定したチオエーテル結合体MCC（4−［N−マレイミドメチル］シクロヘキサン−1−カルボン酸エステル）を介して微小管阻害薬DM 1（メチルタンシン誘導体）と共有結合したヒト化抗−HER 2 IgG 1クトゥールビーズ単抗を含むHER 2を標的とするADCであり、分子量分布範囲は147 ~ 158 kDaであり、その薬物／単抗結合比（drug to antibody ratio、DAR）は0 ~ 8、平均DARは約3.5である［3］。その構造の複雑さのため、それを特徴づけることは非常に挑戦的である。本論文の研究では、今年米国質量分析年次総会（ASMS）で発表されたばかりの次世代2 in 1超高分解能質量分析計Excedion Pro BiopharmaKADCYLAに対して全面的な特徴づけを行い、このプラットフォームが生物製薬分野における優れた分析能力、特に電子転移解離補助高エネルギー衝突破砕（electron-transfer/higher-energy collision dissociation、EThcD）機能を証明し、正確な薬物カップリング部位の鑑定及び翻訳後修飾（Post-translational modification、PTM）の鑑定に役立つ。

応用のハイライト

前述したように、今年新たに発表された次世代2 in 1超高分解能質量分析計Excedion Pro Biopharmaは、KADCYLAの深い特徴付けに使用されている。この装置のハイライトには、m/z=12000 Daまでの質量検出範囲（BioPharma optionを構成する必要がある）を含むが、それに限らず、モノクローナル抗体モノマー/二量体/三量体、その他の高分子量タンパク質複合体の分子量測定を満たすことができる。オプションのETD機能は、高速で感度の高いETD/EThcDフラグメンテーションを実現し、高エネルギー衝突フラグメンテーション（Higher-energy Collisional Dissociation、HCD）と組み合わせて使用することができ、全面的に豊富なタンパク質配列カバー度及びPTM鑑定情報を得ることができる。Excedion Pro Biopharma機器の構造を図1に示し、図2は今回の実験におけるKADCYLAの深いキャラクタリゼーションの流れを示している。

図1.Excedion Pro BioPharma構造図。先代製品のハードウェア更新部分に比べて青色でハイライト表示されている。オプションのBioPharma Editionは、質量検出範囲をm/z=12000 Da（緑のブロック部分）に広げることができ、オプションのETDはETD/EThcDフラグメンテーション（赤のブロック部分）を実現することができる。（クリックしてグラフを見る）

図2.KADCYLAキャラクタリゼーションフローチャート。

（クリックしてグラフを見る）

すべてを下にスライド

非変性条件下でのKADCYLA完全分子量測定

完全分子量測定は生物医薬品類製品の特徴付けの中で必ず少なくない項目であり、ADCにとって、完全分子量のほか、平均DAR値と薬物負荷分布（drug load distribution、DLD）も薬物品質を評価する重要な属性である。本実験では、非変性条件下でKADCYLAの完全分子量測定を行った。非変性条件は中性緩衝塩系を使用し、変性条件に比べてタンパク質分子は天然状態に近く、非変性条件ではタンパク質帯電が少なく、隣接電荷状態間の質量スペクトルピークの重複が少なく、質量スペクトル信号間の相互干渉を低減でき、より正確な完全分子量測定結果を得るのに役立つ。図3は、KADCYLA非変性条件下での完全分子量測定の結果を示す。サンプルを天然状態に近づけるために、脱糖処理は行っていません。図3 Aから明らかなように、原始スペクトルレベルでは、異なる数の薬物と異なる糖型成分を結合した質量スペクトルピークは基本的にベースライン分離を実現し、解畳み込み後に0 ~ 8の薬物結合分布がはっきりと観察され（図3 B）、BioPharma Finderソフトウェアは自動的に平均DAR値を計算することができ、このADCの平均DAR値は3.47（図3 C）であり、文献報告の3.5と一致している。

（A）

（B）

（C）

図3.非変性条件下でのKADCYLA完全分子量測定結果。 A,元のスペクトル図と部分拡大図。B,デコンボリューションスペクトルC，BioPharma Finderソフトウェアは、関連する成分を自動的に選択し、平均DAR値を計算することができる。（クリックしてグラフを見る）

すべてを下にスライド

データ依存性のEThcD二次フラグメンテーションをペプチドパターン解析に用い、

カップリング部位の位置決め及びPTM同定を実現する

液質併用に基づくペプチドグラフ分析は生物治療型製品の特徴付けにおける常用分析方法の一つであり、配列被覆度、各種化学修飾部位の定位及び一般的な翻訳後修飾の定性定量分析などを実現することができる。各種質量分析フラグメンテーション技術において、HCDフラグメンテーションはペプチド結合を切断した後に豊富なb/yフラグメンテーションイオンをペプチドセグメントの同定に用いることができるため、ペプチドパターンの分析に広く応用されている。しかし、いくつかの修飾ペプチドセグメント、例えば糖ペプチド、リンカー-薬物カップリングペプチドセグメントなどに対して、HCDは糖鎖/リンカー-薬物カップリングを砕くため、複数の潜在修飾部位があるペプチドセグメントに対して、HCDフラグメンテーションを使用して修飾部位を正確に位置決めすることができない、また、ロイシン/イソロイシン、アスパラギン/アスパラギン異性化などの異性化アミノ酸を含むいくつかのペプチドセグメントについては、HCDによるb/yイオンの品質が同じであるため、区別することができない。ETDは反応メカニズムが異なるため、ペプチドセグメント骨格をフラグメンテーションしながら糖鎖、リンカー−薬物カップリングなどの側鎖修飾を完全に保持することができ、異性化アミノ酸に対しても、特徴的な診断イオンを生成することができ、それによって異性化アミノ酸の鑑定と区別を実現することができる。ETDフラグメンテーションにHCD補助フラグメンテーション、すなわちEThcDを添加することで、同じ2次スペクトルにb/yおよびc/zイオンを同時に得ることができ、ペプチドセグメント、特に修飾/異性化ペプチドセグメントのキャラクタリゼーションを実現するためのより包括的で豊富な情報を得ることができる。Excedion Pro 2 in 1超高分解能質量分析計はETDオプションを搭載した後、迅速で感度の高いETD/ETchDフラグメンテーションを実現でき、データ依存性のEThcD 2次フラグメンテーション（data dependent EThcD MS 2、dd EThcD MS 2）データ収集モードを設定でき、データ依存性のHCD 2次フラグメンテーション（dd HCD MS 2）と相補的に形成し、全面的なペプチドグラフ解析情報を得ることができる。

本文の研究では、TrypsinとAspNの2種類のプロテアーゼを用いてKADCYLAを変性酵素分解し、その後、2種類の異なるプロテアーゼ分解のサンプルに対して、dd HCD MS 2及びdd EThcDMS 2データ収集を行い、配列被覆度、カップリング部位分布及び翻訳後修飾などの情報を得た。dd HCD MS 2、TrypsinおよびAspN酵素分解を用いたサンプルは、いずれも1針注入100%配列被覆率を達成することができた（データは示されていない）。図4はdd EThcDMS 2、TrypsinとAspN酵素分解を用いた試料ペプチド図分析の基底ピークスペクトル（Base Peak Chromatogram、BPC）及び配列カバー図を示し、同様に1針注入100%配列カバー度を達成でき、Excedion Pro二合一超高分解質量子計のETD/ETchDフラグメンテーションが従来の流速液クロマトグラフィーと互換性があり、ペプチド図分析に高品質の二次スペクトルを得ることを証明した。

図4.KADCYLAペプチド図分析ベースピークスペクトルと配列被覆度は、いずれもdd ETchDMS 2データ収集モードである。左、Trypsin酵素分解サンプル。右、AspN酵素分解サンプル。異なるプロテアーゼ分解サンプルに対して、単針注入100%配列カバーを実現することができる。（クリックしてグラフを見る）

前述したように、KADCYLAの連結子−薬物（MCC−DM 1）はリジンに共有結合結合によって結合されており、トラトールビーズ単抗のN末端も結合するため、KADCYLA分子全体にとって潜在的な結合部位は92個あり、そのうち重複しない部位は46個である（図5）。リジンが共有結合結合されると空間的な障害が発生し、trypsinの漏切を引き起こすため、trypsin酵素分解は複数のリジンを含むリンカー−薬物結合ペプチドセグメントを生成し、HCDフラグメンテーションはペプチドセグメントの骨格と結合薬物を同時に破壊し、HCD二級スペクトルだけで薬物結合部位を正確に判断することができない。EThcDはフラグメンテーション機構が異なるため、ペプチドセグメント骨格をフラグメンテーションしながら薬物カップリング基を保持することができ、最適化後のHCD補助フラグメンテーションエネルギーはペプチドセグメントフラグメンテーションをより十分にすることができ、同時に完全カップリングの薬物を最大限に保持することができる。表1はHCDとEThcDをそれぞれ用いてTrypsin酵素分解試料に対して二次破砕を行い、得られた薬物カップリング部位情報のまとめを示し、46の潜在修飾部位の中で、43の薬物修飾の存在を同定し、EThcD破砕を使用することができ、複数の潜在カップリング部位を含むペプチドセグメントに対して、カップリング位置を正確に位置決めし、HCD結果と結合し、全面的で詳細なカップリング部位情報を得ることができる。

図5.KADCYLA分子のすべての潜在的修飾部位は、赤色のブロックでタンパク質配列中に表示され、合計92個の部位があり、そのうち重複しないものは46個の部位がある。

（クリックしてグラフを見る）

表1.KADCYLA鑑定サイトのまとめ

（クリックしてグラフを見る）

赤いフォント、結合部位。「++」、カップリング部位は二次フラグメントイオンにより確認できる。「＋」、このペプチドセグメント上にカップリングが存在するが、断片イオンによって特定のカップリング位置を確認することはできない。"-"、カップリングが認識されていません。

すべてを下にスライド

AspNを用いてKADCYLAを酵素分解すると、重鎖は3つのリジンを含むペプチドセグメントDを生成するK(216)K(217)VEPK(221)SC，また、trypsin酵素分解試料のペプチドグラフ解析結果から、これら3つのリジンはいずれもカップリングされる可能性があることが分かった。KADCYLAのMCC-DM 1リンカー-薬物は異性体中心（図6、左上）を含み、その結果、薬物カップリングペプチドセグメントは逆相クロマトグラフィー上で対ピークの形で溶出される。図6に示すように、ペプチドセグメントDK(216)K(217)VEPK(221)MSCの抽出イオンフローチャート（Extract ion current，XIC）は複数組の対ピークを示す。EThcDフラグメンテーションによる情報豊富な二級スペクトルのおかげで、異なる保持時間で溶出されたペプチドセグメントがどの部位でカップリングされているかを正確に同定することができ（図6、下）、そしてXICピーク面積に基づいて各修飾の相対割合を計算することができる（図6、右上）。

図6.複数のカップリング部位を含むペプチドセグメントのEThcDによるカップリング部位同定。（クリックしてグラフを見る）

ADCサンプルについては、医薬品のカップリング部位のほか、医薬品の品質に関連する各種の翻訳後修飾も特徴づけと監視が必要である。【図7】EThcD二次フラグメンテーションスペクトルに基づくペプチドセグメントFNWYVisoD(283)GVEVHNAKのアスパラギン異性化の同定結果。機器プラットフォームの高感度と高品質精度のおかげで、相対的な含有量が未修飾ペプチドセグメント0.18%の異性化ペプチドセグメントだけであっても、豊富なc/zイオン、そしてアスパラギン異性化がETDフラグメンテーション中に発生する特徴的なc+57/z-57イオンを同定することができ、それによってアスパラギン異性化の確証を実現することができる。他の一般的な翻訳後修飾、例えば脱アミド、酸化、グリコシル化などに対して、比較的定量的な結果を得ることができる（図8）。

図7.EThcDフラグメンテーションを用いてアスパラギン異性化を確認する。下の部分拡大図では、c+57/z-57イオンを観察することができます。（クリックしてグラフを見る）

図8.その他の一般的な翻訳後修飾相対定量結果は、すべての結果が3針dd ETchDMS 2反復注入平均値である。A,メチオニン酸化。B,アスパラギン脱アミド。C,アスパラギン酸コハク酸イミド化。D,ロイシン酸化E,重鎖N−グリコシル化。（クリックしてグラフを見る）

すべてを下にスライド

まとめ

本論文では、次世代二合一超高分解能質量分析計Excedion Pro BioPharmaを用いてリジンカップリングADC KADCYLAを特徴づける実験結果を示した。非変性条件下でKADCYLAに対して完全分子量測定を行い、脱糖しない条件下で薬物カップリング数0 ~ 8の分布を測定することができ、ソフトウェア処理後に得られた平均DAR値は3.47であり、報告された3.5と一致している、迅速で敏感なEThcDフラグメンテーションは単針注入100%配列カバー、一般的な翻訳後修飾鑑定と相対定量を実現できるだけでなく、カップリング部位鑑定、異性化アミノ酸鑑定などを実現でき、複雑な生体分子の全面的な特徴付けに信頼できる結果を提供する。

参考文献：

[1] Fu, Z.、Li, S.、Han, S. et al. 抗体薬の結合物：ターゲットがん治療のための「生物ミサイル」。Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert, N.、Beck, A.、Dumontet, C.、Denevault-Sabourin, C.、Antibody-Drug Conjugates: The Last Decade。医薬品2020、13、245。

協力して本文を転載する必要があれば、文末にメッセージを残してください。