誤解1：計器通路は多ければ多いほど良い

PCR技術の成熟した運用に伴い、多重増幅はますます盛り上がり、蛍光定量PCR計も免れない。zui初のABI社が発売した単チャンネル蛍光定量PCR計から、現在では各メーカーが4チャンネル、5チャンネル、さらには6チャンネル蛍光定量PCR計を発売しており、目まぐるしい選択に戸惑い、うっかり「チャンネルが多ければ多いほど良い」という誤解に入ってしまった人もいる。

一部のメーカー5チャンネルの蛍光定量器を使用する場合、実験結果の性と正確性を確保するために、これらの蛍光染料はすべて1つの検出チャンネルを単独で使用しなければならないROX（蛍光染料）またはReference dyeを実験に使用しなければならない。このようにして、本当に多重PCR蛍光信号を検出できる有効なチャンネルは4つしかなく、補正染料を使用すると後期の使用コストが増加する可能性がある。蛍光定量PCRの検出チャンネルの中には、自社メーカーの蛍光染料や試薬のためだけに開放されているものもあり、有効な検出チャンネルも決して宣伝資料で宣伝されているほど多くはない。購入前に蛍光定量PCR機器の有効な検出経路を確認することは特に重要であり、宣伝だけを聞いてはいけない。多重蛍光定量PCRのチャンネル数を考慮する場合も実験室の実際の状況から出発すべきであり、多重PCRは誰もが適用し、誰もが利用できるわけではない。実験を複雑化させたからだ。

誤解その2：real-time PCR計は勾配機能を必要としない

染料法を用いた定量的PCR反応には、様々なPCRプライマー設計ソフトウェアや経験式を用いて溶解温度（Tm値）を計算することがあるが、運用する式が異なり、プライマー配列が異なり、Tm値の差が大きい。プライマーの溶解温度はアニール温度を決定する。また、テンプレート中の塩基の組み合わせは千変万化しており、特殊な断片に対して、経験式で得られたデータは必ずしも正確な結果を得ることができるとは限らず、アニール温度の微妙な違いは結果に決定的な影響を与える可能性があるため、「条件を触る」ことは一時は頭を悩ませる問題だった。勾配PCRの出現部分はいくつかの問題を解決した：反応過程における各孔の温度制御条件は範囲内で勾配に従って変化することができ、結果に基づいて、一歩で模索できる反応条件。

アニーリング温度だけでなく、変性温度と延伸温度も最適化することができる--Invitrogen、Clontech、Promegaなどの多種のポリメラーゼ混合酵素の増幅にとってこれは非常に重要であり、Taqと校正酵素の*反応温度に顕著な差がある可能性があるため、延伸温度を最適化することが重要である。

勾配機能のある蛍光定量PCRを使用することで、これまでの複数回の実験でしかできなかった最適化過程を一度に完成でき、PCR反応条件を模索する煩雑な実験を簡略化し、実験時間の引き上げ率を節約するだけでなく、実験コストを節約することができる。