マトリックス効果（matrix effect/matrix interference）とは、試料中の他の物質が標的分析物を検出する能力に影響を与える可能性があり、血清、血漿、組織均質などの生物試料の免疫検出に最も一般的である。このような試料中の多くの成分、例えば炭水化物、タンパク質、リン脂質、代謝物などは、抗体と標的との結合を妨害したり、信号を抑制したり増強したりして、分析物の正確な定量に影響を与えるからである[1]。

臨床研究の生物分析において、マトリックス干渉はさらに大きな挑戦である。例えば、血清と血漿中にはすでに多種のタイプの干渉が発見されており、通常はリウマチ因子、好性抗体（不明確な抗原に対して産生された抗体で、低親和性と弱結合を呈する）、ヒト抗動物抗体（HAAA、免疫系が動物抗体と接触したときに産生された高親和性抗体）及びその他の血漿蛋白質、例えばアルブミン、リゾチーム、フィブリノゲンなどの内因性物質である[2]。これらの干渉因子は検出の感度、特異性と変異性に直接影響し、分析物の定量的不正確をもたらす。

マトリックス効果を低減するための最も基本的な方法はサンプルの希釈であるが、希釈後の分析物のレベルが線形範囲内にあり、希釈は検出感度に影響するため、一般的な戦略ではないことを前提としている。緩衝液pHとイオン強度を最適化することは、非特異的相互作用の低減にも役立つ。干渉を克服する他の戦略としては、適切な動物血清カクテルを用いてヒト抗マウス抗体（HAMA）を受動的に除去するなど、干渉分子と結合したり競合する物質を加えること、好気性ブロッキング剤（HBR）や免疫グロブリン抑制試薬（IIR）などの好気性抗体抑制剤を使用すること、Fc断片が不足しているF（ab’）2や単鎖断片（scFv）を捕捉／検出試薬として使用することなどが挙げられるが[3]。しかし、これらの方法の多くは労働集約型で高価であり、大試料量の研究には実用的ではない。

リガンド結合試験（ligand binding assay、LBA）に基づく免疫検出に対して、培養時間を減少させるか、試薬がマトリックスと接触する時間を検出することはマトリックス効果を克服する有効な手段の1つであることが証明されている[4]。Gyrolab®マイクロフロー制御されたCD上で親和カラム流穿孔モードを実現することにより、試薬とマトリックスとの接触時間を最小限に抑え、マトリックス干渉を最小限にすることができる。Bristol-Myers Squibb社のShannon D Chilewskiら[5]Gyrolabを利用®プラットフォームは臨床前PK研究における基質干渉問題を解決した。

この例は、あるPEG化抗体のPK検出においてヒト抗動物抗体（HAAA）に由来するマトリックス干渉が観察された。薬物発見段階において、単回投与量の増加（single ascending dose、SDA）研究を支援するための検出方法は、標的分子を捕捉試薬とし、ヤギ抗Vk抗体を検出試薬とし、試料の希釈度は50倍、定量下限LLOQは80 ng/mLである電気化学発光検出（ECL）に基づく方法である。

しかし、発見段階から開発段階に移行する際には、より低い検出感度が要求され、精度と精度を維持または向上させながら、ECL検出方法80 ng/mLのLLOQは次の3つの理由で次の段階の研究をサポートするのに適していない：

1開発チームはこの薬物の低用量での半減期特徴に興味を持っており、現在の検出方法を踏襲すれば、結果は

2受容体占有率EC 50が78 ng/mLのときに循環中の薬物濃度を測定することが望ましい、

3免疫原性が出現した場合、抗薬抗体は薬物に対して除去作用があり、循環中の薬物レベルを低下させる可能性があるため、この検出方法は低用量での薬物定量にさらに制限されると推定される。

　検出感度を高めるためにLLOQを要求される30 ng/mLまで拡張し、研究チームはGyrolabの採用を模索した®プラットフォームと新しい試薬を組み合わせ、限られた時間内に新しい検出方法を迅速に開発する。

まずGyrolabで®上で捕獲と検出試薬の組み合わせをスクリーニングし、ヤギポリクローナル抗薬抗体を捕獲試薬とし、マウスの抗特別型単抗薬を検出試薬とし、この組み合わせは最適な性能を示し、捕獲抗体濃度は100µg/mL、検出抗体濃度は2500 ng/mLであった。Gyrolabを使用する® Bioaffy 200 CD（サンプル体積200 nL）と標準的なGyrolab®三段階法（捕捉−分析物−検出）により分析を行い、試料希釈MRDは2であった。

PBS−Tは希釈緩衝液（PBS＋1%BSA＋0.05%Tween−20）としてサンプルを2倍希釈した。CDテストは3日間で6回行われた。各CDは、標準曲線と6段階のQCサンプルの4つの繰り返しを含む。標準曲線範囲は30-2000 ng/mL、アンカー点は2500 ng/mLである。QCサンプルを100%ヒト血清中で125倍希釈した後、濃度が測定範囲内に収まるように検出緩衝液で2倍希釈した。表1は、すべての結果に良好な検出精度と精度があることを示している。

サンプルをPBS−T緩衝液とGyros特許のRexxip H緩衝液（Gyros）でそれぞれ希釈して平行比較した。測定方法にはマウスの単抗が含まれており、ヒト抗マウス抗体HAMAは潜在的な干渉源であり、RexxipH緩衝液は好異性抗体を中和する成分を含んでいるため、Rexxip H希釈を使用するとマトリックス干渉信号を抑制できるはずである。

20個の血清サンプル（10人の健常者の血清NHS 1-10、10人の罹患者の血清DPS 1-10）を30 ng/mLのLLOQ濃度で薬物を混入して分析し、すべての20個のサンプルも無添加の分析を行った。検収基準：80%の添加サンプルは公称濃度±25%の偏差範囲内で回収する必要があり、すべての添加サンプルの回収はLLOQより低くなければならない。結果（表2）により、正常人血清サンプルはRexxip H緩衝液を用いて希釈した後、目標受入基準を満たした。正常ヒト血清2号試料は、PBS−Tを用いた回収率が252.6%、RexxipHを用いた回収率が25%以内であり、RexipH緩衝液がこの試料中のマトリックス干渉を非常に良く除去したことを示している。そのうち2つの疾病血清サンプルは標準サンプルを添加していない場合、Rexxip H緩衝液を使用しても、その逆算濃度は32 ~ 35 ng/mLである。そのため、疾患者の研究設計においては、標準化実験を繰り返し、LLOQを40 ng/mLに設計しなければならない。

まとめ：

電気化学発光（ECL）検出方法（LLOQ 80 ng/mL）をGyrolabに移行した®プラットフォームでは、最適化された抗体対と緩衝液を用いて、より感度の高い検査結果を生成し、LLOQを30 ng/mLに改善し、将来の研究の要求を満たすことができる。

Gyrolab® プラットフォームの親和柱流穿孔モード及び特許のRexxip緩衝液はマトリックス効果によるデータ精度と感度の低下を最大限に低減することができる。

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参考文献：

[1].セルビー C. 免疫測定の干渉アン・クリンバイオケミック36(Pt 6), 704–721 (1999)。

[2].アナ・I・バーボサ、ヌノ・M・レイス抗体表面カバージャーは微流体毛微抗体免疫測定におけるマトリックス干渉を運転します。ACSセンサー2021 6（7）、2682-2690。

[3].ウィリアムズ K、エリックソン R、フィッシャー SK. マイクロ流体免疫測定技術を使用して臨床薬物動力学測定における疾患特異性マトリックス効果を克服する.Bioanalysis, 9(16), 1207-1216 (2017)。

[4].サルーメ・K・フィッシャーリガンド結合アッセイ技術:バイオ分析の課題に適したツールを一致させる.https://www.bioanalysis-zone.com.

[5].シャノン・D・チレウスキーリガンド結合アッセイにおけるマトリックス効果に対処 新しい試薬と技術の使用を通じてBioanalysis (2014) 6(8), 1059-1067。