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Beijing Chaoweijing Biotechnology Co., Ltd
呉潤龍課題グループは広視野蛍光ナビゲーションシステムを開発し、自由行動動物の高効率多光子イメージングを賦能
日付：2025-07-15読み：3
背景（はいけい）
単光子（1 P）、二光子（2 P）、三光子（3 P）顕微鏡技術を含む蛍光イメージング技術は、神経科学の発展を大きく推進した。特に微細化蛍光顕微鏡の出現は、自由活動動物におけるニューロン構造と活動観察の新しいパラダイムを開いた。単光子励起の高効率のおかげで、微細化単光子顕微鏡（m 1 PM）はLED光源を用いて数ミリ範囲の照明及び対応する結像視野（FOV）を実現することができる。しかし、光学的スライス能力が不足しているため、m 1 PMの体内イメージングの解像度は限られており、樹状棘などの微細構造を観察することはできない。二光子イメージング技術は固有の光学切片化能力と深層組織透過能力を有し、その中で微細化二光子顕微鏡（m 2 PM）は自由活動マウスの脳におけるニューロンシナプスのイメージングを実現した。この技術はさらに発展してイメージング視野を1×0.8 mm 2に拡大し、同期三色イメージングを実現し、854µmのイメージング深度に達した。また、微細化三光子顕微鏡（m 3 PM）は三光子効果を利用して、結像深度を1 mmを突破した。
微細化多光子顕微鏡は自由活動動物イメージングにおいてますます重要な役割を果たしているが、その実践的応用は多くの課題に直面している。多光子顕微鏡の優れた光学スライス能力により、被写界深度が浅く（3〜20µm、軸方向分解能により決定）、結像視野は通常1 mm 2以内である。ガイドが不足している場合、数ミリの頭蓋窓または勾配変化屈折率レンズ（GRIN Lens）にまたがる3次元空間において、目標関心領域（ROI）を迅速に位置決めすることは依然として挑戦的である。特に経験の乏しい研究者にとっては、ROIを確認し、マウスの頭部にマイクロ化顕微鏡を取り付けるのに数十分から数時間かかる可能性があり、自由行動動物研究におけるこの技術のさらなる応用を大きく制限している。
この問題を解決するために、開発チームは初期の作業で広視野（WF）対物レンズとm 2 P Mヘッドマウント装置の小型化対物レンズ（FHIRM-TPM）を結合し、位置決めのための広視野蛍光イメージング装置を作成した。しかし、初期の微小化対物レンズの視野は限られていた（約150µm）ため、数ミリ幅の頭蓋窓内ではまだ興味のある領域を迅速に探すことは困難であった。また、m 2 PMイメージングに切り替える際には、広視野対物レンズの動作距離が限られているため（約37.5 mm）、光ファイバを大きく曲げる必要があり、操作がより困難になる。最近、Zongらはm 2 P Mヘッドセットを固定するための回転テーブルを導入し、角度調整により特定の脳領域とのより良いアライメントを実現した。これらの進展にもかかわらず、3次元脳組織における興味領域の迅速な局在化には課題があり、新しい研究者に急峻な学習曲線をもたらした。また、現在のm 2/3 PMの動作距離は2 mm未満であり、z軸プラットフォームを使用して焦点平面を位置決めする場合、サンプルや対物レンズは極めて損傷しやすく、経験不足のユーザーに特に顕著である。総じて、誘導機能を強化した多モードイメージングプラットフォームを開発し、自由活動動物の効率的なイメージングを実現するための標準化ワークフローを構築する必要がある。
多モード蛍光イメージングプラットフォームのシステム設計
この問題を解決するために、開発チームは多モード蛍光イメージングプラットフォームを設計し、広視野蛍光ナビゲーションシステム（WF-Nav）と微細化二光子顕微鏡イメージングと微細化三光子顕微鏡イメージングを統合した。単光子励起の利点を十分に発揮するため、WF-Navシステムは大視野と単細胞分解能機能を搭載し、指定された関心領域を迅速に識別することができる。ターゲット領域に位置すると、システムは二光子または三光子イメージングにシームレスに切り替えられ、さらに高信号対雑音比または深層ニューロンイメージングを実現することができる。その後、m 2 PMまたはm 3 PMプローブをマウスの頭部に固定し、マウスを解放して自由活動イメージングを行った。
図1.多モード蛍光イメージングシステムの設計
広視野蛍光航法システム設計
WF−Navシステムは、多色大視野広視野顕微鏡と多機能アダプタから構成されている。このシステムは励起光源（405 nm、473 nm、561 nm）として3つのLEDを採用し、高開口数の非球面集光レンズを搭載してLEDビームをコリメートし、各励起光路に対応するフィルタ群を備えている。大視野ナビゲーションを実現し、多光子ミラー群をシームレスに切り替えるために十分な空間を提供するために、開発チームは長作業距離、低倍率の乾式対物レンズを設計した。この対物レンズ（3.3 x）は逆望遠設計を採用している：前群は2枚の接着双合レンズに負の光焦点度を提供し、後群は1枚の球面レンズから構成される。この構造は主平面を後方に移動して色差を補正し、開口数を維持しながら超長有効焦点距離の動作距離を実現し、最終的に90 mm動作距離の突破性指標を達成し、Φ5.64 mmの最大撮像視野を実現した。
図2.広視野蛍光顕微鏡設計
広視野モードと多光子撮像モードのシームレスな切り替えを実現するために、チームは多機能アダプタを設計した。アダプタはワイドフィールド対物レンズに接続され、Z軸電動プラットフォーム上で焦点距離調整を行う。標準化されたm 2/3 PMプローブ設計により、プローブは同じステントにしっかりと取り付けられ、多光子と広視野モードの切り替え時のピント合わせイメージングを保証することができる。
図3.多機能アダプタとピント合わせ機能
この90 mm動作距離の対物レンズは、操作ヘッド、光ファイバ、または着脱可能な電動ズームレンズモジュールの設置に十分なスペースを提供します。ヘッドブラケットは摺動抵抗が極めて小さく（約0.1 N）、伸縮距離が12 mmの軽量直線ボールレールに取り付けられ、対物レンズとサンプルの衝突リスクを効果的に回避することができる。ヘッドブラケットを交換することにより、システムはmini 2 Pやm 3 PMなどの異なるヘッドピースと互換性があります。また、従来の卓上型対物レンズに比べて、システムはほとんどの方向により大きな観察角度を提供し、より広いサンプル観察範囲をもたらしている。この設計はサンプルの粗位置決め効率を著しく向上させた。
図4.異なる対物レンズと微細化二光子顕微鏡の観察角の比較
次に、開発者は広視野蛍光顕微鏡の光学性能と実用的な応用を評価した。Thy 1-YFPHマウスの脳スライスをイメージングすると、ニューロンと軸索を明確に識別することができる。470 nm波長で生体カルシウムイオンイメージングを行い、561 nm波長で形態学イメージングを行い、3804個のGCAMP 6 f標識ニューロン及び4650個のmCherryを発現するマウス星形質膠細胞を捕獲することに成功した。これらの結果は、このワイドフィールド顕微鏡が多色、単細胞分解能、高スループットイメージング能力を備えており、関心のあるターゲット領域のナビゲーションに優れた性能を提供していることを証明した。
動画5.微細化ワイドフィールド顕微鏡による高スループットイメージング
標準化されたマイクロ多光子顕微イメージングプロセスの確立
自由行動マウスにおけるm 2 PMイメージングをより円滑にするために、開発者は自由行動動物におけるm 2 PMイメージングの効率を高めるための標準化イメージングプロセスを構築した。まず動物に対してウイルス注射と外科手術操作、例えば頭蓋窓移植あるいはGRIN Lens移植を行い、その後2-4週間待ってウイルスの十分な発現と手術損傷の回復を確保する。ある実験を例に、私たちは一次運動皮質（M 1）ニューロンにGCAMP 6 sとmCherryを標識し、その後マウスをWF-Nav装置下のトレッドミルに固定した。次に、ワイドフィールド顕微鏡によってターゲットの関心領域を位置決めし、視野中心に位置合わせする。その後、アダプターを介してm 2 PMモードに切り替え、920 nmと1030 nmの波長で2色2光子イメージングを行い、最後にXY軸と焦点面を微調整し、数分以内に最終的な目標領域を確認することができる。ほとんどの場合、セメントの収縮による焦点のずれを補償するために、目標焦点面を約25µm持ち上げ、Baseplateを動物の頭部のヘッドピースに固定し、約10分間硬化した後、マウスは自由活動イメージングを行うことができる。
図6.標準化自由可動マイクロ二光子顕微イメージングフロー
開発者はマウスの社交実験においてニューロンのカルシウム信号と構造をイメージングし、このシステムを検証し、設置操作過程全体で約20分かかり、成功率は100%（n=15）に達し、経験のない研究者でも簡単に把握でき、実験効率を大幅に向上させた。また、M 1区の第2層ニューロンと星状膠細胞に対して複数日反復イメージングを行った結果、Baseplateを再インストールせずに視野配置が安定していることが明らかになった。
図7.複数日同じ視野イメージング
標準化された機械設計のおかげで、m 3 PMイメージングヘッドはステントに容易に取り付けることができる。ワイドフィールドモードから3光子撮像モードへのシームレスな切り替えを可能にする多機能アダプタを適用します。広視野単一光子顕微鏡の撮像深度には限界があるため、深層信号の検出が困難になることが多い。浅表血管は一定の参考とすることができるが、表層を保持するウイルス注射領域は、より直接的な蛍光標識を提供し、垂直軸上のより深い部位の位置合わせを容易にすることができる。開発者は頭を固定し、GCAMP 6 fを発現したマウスの中で、皮質表面から1020μmまでのpostsubiculum区の神経活動を記録することに成功し、そしてマウスの広間行動探索実験を行い、670μmの深さで長時間カルシウム信号活動を記録した。
図8.微細化三光子固定と自由挙動イメージング
この仕事は北京情報科学技術大学の呉潤龍教授（通信著者）、北京大学の王愛民、程平和教授らが完成した。
【参考文献】
Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. 自由に行動する動物における効率的なミニチュアマルチフォトンイメージングのためのワイドフィールド ・ ・ 荧光ナビゲーションシステム。神経光学。 2025;12(2):025018.ドイ：10.1117/1.NPh.12.2.025018
ハイパービューは、スーパーノヴァ-100、スーパーノヴァ-600、スーパーノヴァ-3000、スーパーノヴァ-SMARTなど、ワイドフィールドナビゲーションシステムを導入した微細化多光子スーパーノヴァ全系製品に適用する。すべての微細化多光子顕微鏡ユーザーが実際のイメージング過程で、より便利で、より安全で、より効率的な操作体験を実現することができるようにする。