ポリクローナル抗体製造サービス

ポリクローナル抗体製造サービス

多抗一般製造プロセス：＊抗原の準備－＋ウサギの免疫－→効力価測定と最終放出－＋抗体親和精製－＋抗体の濃縮と保存。

具体的な実験手順は以下の通りである：

1.ウサギの準備

健康的な6週間サイズのニュージーランドオオシロウサギ2匹（約2 Kg）を選び、新しい生活環境に適応させ、少なくとも数日安定してから*採血、予備採血（陰性参照用）を行う

1.1ウサギを慎重に固定された棚に入れて、ウサギを落ち着かせる。

1.2ウサギの耳の毛を丁寧に剃って血管をはっきり見えるようにする（剃らなくてもよい）、

1.3必要であれば、小綿球にアルコールをつけて血管部位を塗布して血管を膨張させることができる。

1.4注射器を用いて耳静脈から約10 mlの血液（約5 ml血清）を抽出する、

1.5針を慎重に抜き取り、出血しないように適切に傷口を押し、その後アルコール綿球で傷口を消毒する。

1.6収集した血液を37 Cに置いて30 min不活化し、その後4'Cに一晩置いて凝結させて血清を放出する、

1.7凝結した血液を10000 r/minで10 min遠心分離する、h.上清を収集する、すなわち血清である。

ウサギの免疫

2.1ウサギ2匹を注射する抗原は1 mlであり、抗原緩衝液はウサギに有害な化学試薬を含まない必要があり、ウサギ1匹当たりの初回免疫400 ug抗原が適切であり、適切に減少してより良い結果を得ることができ、後続免疫は毎回100 ugであればよい。

2.2 1 mの仏氏*アジュバントと準備した1 m抗原を十分に混合し、乳白色を呈する。 .

2.3ケージからウサギを慎重に取り出し、ウサギの免疫4つの部位（背中と太ももの付け根はどちらでもよい）を編んで、各部位250 ul、針は45度角を呈して皮下1-2 cmに挿入し、注射後数秒滞在して抗原流出を防止する。

2.4ウサギ疫病の周期は20日で、免疫完了後7〜10日に採血（中途試験採血と終末放血を含む）し、合計4〜5回免疫する。

3.価格測定

3.12個の参照陰性参照は血液血清の予備採取であり、いずれも1抗開始濃度で希釈した（閉鎖希釈液）、陽性参照は以前

陽性血清

3.2 96ウェルプレートに100 ul、1 ug/m抗原を滴下し、49 Cで一晩、37°Cで2時間インキュベートすることもできる。

3.3抗原溶液を捨て、1ウェル当たり200 uの閉鎖液を加え、49 Cを一晩または379 Cで2時間インキュベートする。

3.4閉鎖液を逆さにし、吸水紙に残留液をできるだけ吸引乾燥させ、洗浄液で板を洗う3回、毎回残留液をできるだけ乾燥させ、一定時間放置する場合、37°Cは乾燥させ、封ポケットで20°Cよりよく封をして保管する。

3.5梱包された96穴のプレートを取り、第---孔は陰性参照液100 ulを添加し、第2孔は陽性参照液100 ulを添加し、第3孔は1：500の測定すべき抗血清を添加し、後続の各孔はこれに基づいて倍比希釈し、37°Cで1時間インキュベートした。

3.6液体を捨て、洗浄液で板を3回洗って、たたいて乾かす。1ウェル当たり100 uのHRP標識マウスをウサギlgG（1：2000希釈）に抗して添加し、37°Cで45分間インキュベートした。

3.7液体を捨て、洗浄液で板を3回洗って、たたいて乾かす。各ウェルに100 uのTMB基質（Sigma単成分TMB）を添加して37°Cで5〜20分間インキュベートした（色の濃淡に応じて発色する時間を決定した）。

3.8各ウェルに50 uの終端液（2 NH 2 SO 4）を添加し、酵素スケール上で波長450 nmにおける吸光値を読み取る。

抗体価測定値が100万以上に達した後、ウサギに終放血を行うことができる。

抗体の精製

4.抗体の親和性−親和性カラムの調製

4.1 CNBr−Sepherose 4 Bを1 mg秤量したアガロースゲルを2 mmol/Lの塩酸に加え、4'Cを一晩中十分に溶解させ、3 m溶解膨張ゲルを得ることができる。

4.2ゲルを精製カラムに移し、約20 ml 2 mmol/Lの塩酸で3回洗浄した。

4.3カップリング緩衝液で媒体を洗浄する--回、活性基はカップリング緩衝液PH値で加水分解しやすいので、この工程数分以内に完成する。

4.4カップリング緩衝液5 mlに溶解した抗原5〜10 mgをゲルに添加する

4.5室温で2〜4時間、または4'Cを軽く混合して一晩揺動し、結合効率を測定する必要がある場合は、このステップが終了した後、少量の溶液を採取して測定する。20 mlのカップリング緩衝液を用いて1〜1回媒体を洗浄した。

4.6室温で15 m 1%BSA溶液を加えて2時間または4'Cを一晩インキュベートした。

4.7媒体をリン酸塩緩衝液で3回以上洗浄、毎回15 m以上h.

4.8抗原固相化が完了し、精製に用いることができる。

4.9直ちに使用または使用しない場合、20%エタノールで封止する。

5.抗血清の精製と保存

5.1抗血清をPBSなどの体積で希釈し、5000-10000/minを15分間遠心分離し、上清を採取した。

5.2抗原親和性カラムを10倍体積のPBSで洗浄してカラムを平衡させる。

5.3希釈した抗血清10 mをバランスの良い柱に加える。

5.4室温で2〜4時間、または4'Cを軽く混合して一晩揺動する

5.5抗原カラムを10倍体積のPBSで洗浄し、カラムに結合したヘテロタンパク質を洗浄する

5.6カラムを2倍体積の抗体溶離液で洗浄し、特異的抗体を得る

5.7柱を10倍体積PBSでバランスさせる

5.8柱を20%のアルコールで封印し、4'Cで保存する。

溶出抗体を得た後、ショ糖またはポリエチレングリコールを濃縮した後、PBS中で透析除塩し、紫外可視分光光度計を用いて波長280 nmで抗体OD値を測定し、得られたOD値を1.35で割ると測定抗体の濃度となり、40-50%グリセリンを添加して20 ^ Cに置くと長期保存できる。

一部の実験代行サービス