JC−1ミトコンドリア膜電位検出キット

製品紹介

JC-1ミトコンドリア膜電位検出キット（JC−1ミトコンドリア膜電位検出キット)は、JC-1蛍光プローブであり、細胞、組織、または精製ミトコンドリア膜の電位変化を迅速かつ敏感に検出するキットである。ミトコンドリア膜電位の低下はアポトーシス早期の象徴的な事象である。したがって、本キットは初期のアポトーシス検出に使用することができる。

JC-1ミトコンドリア膜の電位検出に広く用いられている△Ψmビットの理想蛍光プローブ。JC-1染料はミトコンドリア内に電位依存的に蓄積され、細胞、組織、または精製されたミトコンドリア膜電位を検出するために使用することができる。正常ミトコンドリア内、JC-1ミトコンドリアマトリックスに凝集してポリマーを形成し、ポリマーは強い赤色蛍光（Ex=585nm，Em=590nm）；不健康なミトコンドリアは膜電位の低下や喪失により、JC-1セルスラリー中に単量体として存在し、緑色蛍光（Ex=514nm，Em=529nm）。JC-1定性的な検出だけでなく、色の変化によって線粒体膜電位の変化を非常に直接反映することができる。定量的な検出にも用いることができ、ミトコンドリアの脱分極度は赤/緑蛍光強度の割合を測定する。

保存及び輸送：-20℃遮光乾燥保存、少なくとも1年有効。輸送：アイスパック輸送

使用方法 JC−1ミトコンドリア膜電位検出キット

1.JC-1

六孔板に対して、本キットは検出可能である100個のサンプル。穴ごとに必要JC-1染色作動液の量は1ml、その他の培養器の JC-1染色作動液の使用量は以下のように推論する。細胞懸濁液に対して 50～100 0.5 ml JC-1染色作動液 適量を取る JC-1（200×）に従って、毎50μL JC-1（200×)を追加 8mL超純水の割合希釈 JC-1。激しい振動が十分に溶け、混和する JC-1を選択してから、 2mL JC-1染色緩衝液（5×）、混ぜたら JC-1染色作動液

【注意】：まず JC-1（200×）超純水（キット提供）で十分に溶解混和してから、添加することができる JC-1染色緩衝液（5×）。先に割り当てることはできません JC-1染色緩衝液（1×）再加入 JC-1（200×）、このように JC-1十分に溶解することは難しく、後続の検査に深刻な影響を与える。

2. 陽性対照の設定

ソ連（10mM）推奨キー 1∶1000 の割合で細胞培養液に加え、希釈して 10μM、処理細胞 20分。その後、下記の方法で積載する JC-1、ミトコンドリア膜電位の検出を行う。 ほとんどの細胞では 10μM CCCP処理 20分後ミトコンドリアの膜電位は完全（かんぜん）喪失、JC-1染色後の観察は緑色蛍光でなければならない。正常な細胞経は JC-1染色後は赤色蛍光を示すべきである。特定の細胞に対して、CCCP

異なる点があり、関連文献資料を参考にして自分で決定する必要がある。

3. 懸濁細胞について

1）取10～60 万細胞、重懸濁 0.5mL細胞培養液には、細胞培養液中に血清とフェノールレッドを含むことができる。

2)を追加0.5mL JC-1染色作動液は、逆さまに数回混合する。細胞培養箱中 37℃インキュベーション20分。

3）インキュベーション期間は、 1mL JC-15×)を追加 4mL蒸留水の割合、適量の JC-1染色緩衝液（1×)を使用して氷浴に配置します。

4）37℃でのインキュベーション終了後、600×g4℃遠心分離3～4分沈殿細胞上清を捨てて、できるだけ細胞を吸い取らないように注意してください。

5）用 JC-1染色緩衝液（1×）洗浄 2 次：参加 1mL JC-1染色緩衝液（1×）重懸濁細胞、600×g4℃遠心分離3～4分細胞を沈殿させ、上清を捨てる。再加入 1mL JC-1染色緩衝液（1×）重懸濁細胞、600×g4℃遠心分離3～4分細胞を沈殿させ、上清を捨てる。

6 JC-1染色緩衝液（1×）再懸濁後、蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡で観察し、蛍光分光を用いてもよい。（図1）。（図1）。（図1）。（図1）。）。（図3）。（図3）。（図3）。（図3）。（図 光度計による検出またはフローサイトメータによる分析。

4. 壁細胞に対して

【注意】：壁貼り細胞について、蛍光分光光度計またはフローサイトメータを用いて検査することを望むなら、まず細胞を収集し、再懸濁後に懸濁細胞の方法を参考にして検査することができる。

1）六孔板の1つの孔に対して、培養液を吸引除去し、具体的な実験によって必要に応じて使用できる PBSまたは他の適切な溶液で細胞を1回洗浄し、添加 1mL細胞培養液細胞培養液には血清とフェノールレッドが含まれていてもよい。

2)を追加 1mL JC-1作業液を染色し、よく混ぜる。細胞培養箱中 37℃インキュベーション20分。

3）インキュベーション期間は、 1mL JC-1染色緩衝液（5×)を追加 4mL蒸留水の割合、適量の JC-1染色緩衝液（1×)を使用して氷浴に配置します。

4）37℃でのインキュベーション終了後、上清を吸引除去し、JC-1染色緩衝液（1×）洗浄 2 回。

5)を追加 2mL細胞培養液、培養液には血清とフェノールレッドを含むことができる。

6）蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡下で観察した。

5. 精製ミトコンドリアの場合

1）で調製した JC-1染色作動液の再使用 JC-1染色緩衝液（1× 5 倍になる。

2）0.9ミリリットル5ばいきしゃく JC-1染色作動液への添加 0.1mL総蛋白量は 10～100マイクログラム精製されたミトコンドリア。

3）蛍光分光光度計または蛍光酵素スケールで測定：混和後直接蛍光分光光度計で時間走査（時間 スキャン）、励起波長は485nm、送信波長は 590ナノメートル。蛍光酵素スケールを使用する場合、励起波長を 485nm場合は、475～520ナノメートル範囲内で励起波長を設定します。また、次の手順を参照することもできます 6 の波長設定で蛍光検出を行います。

4）蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡で観察する：方法は以下のステップと同じである 6。

6.

検出 JC-1単体の場合は励起光を 490ナノメートル、放出光をに設定 530ナノメートル;検出 JC-1ポリマーの場合、励起光を 525ナノメートル、放出光をに設定 590ナノメートル。

【注1】：ここで蛍光を測定する際に、励起光と発光光を最大励起波長と最大発光波長に設定する必要はありません。蛍光顕微鏡を用いた観察、検出 JC-1ポリマーの場合、ヨウ化ピリジンまたは Cy3用の標準バンドパスフィルタ。検出 JC-1単体では通常を用いて検出することができる FITCまたは GFPの標準バンドパスフィルタを使用します。赤色蛍光が現れたことはミトコンドリア膜の電位が比較的に正常であり、細胞の状態も比較的に正常であることを示している。

注意事項

1）JC-1（200×)が4℃、氷浴などの比較的低温の場合は凝固して遠心管底、管壁または管蓋内に接着、20～25℃水浴を用いて、すべてが融解するまでしばらくインキュベートした後に使用した。

2）ロード完了 JC-1後用 JC-1染色緩衝液（1× JC-1染色緩衝液（1×）を維持する 4

3）JC-1プローブをロードして洗浄した後は、できるだけ 30分内で後続検出を完了します。検査前に氷浴保存が必要です。

4）を把持しないでくださいJC-1染色緩衝液（5×）すべて調製JC-1染色緩衝液（1×），本キットの使用中は直接使用する必要がありますJC-1染色緩衝液（5×）。

5)が検出された場合 JC-1染色緩衝液（5×）に沈殿物があり、すべて溶解してから使用する必要があり、 37℃加熱は溶解を促進する。

6）CCCPミトコンドリア電子伝達鎖阻害剤のために、毒性があるので、注意して保護してください。

7)安全と健康のために、実験服を着て使い捨て手袋をはめて操作してください。

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JC-1 JC-1一部引用文献JC−1ミトコンドリア膜電位検出キット

(1) [場合=9.7]鉄下垂とGPX 4の二重機能による骨関節炎進展への寄与-EBioMedicine リリース日：2022年1月27日 DOI：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.103847

この図の元のデータは文献（1）から出ています。

(2) [もし=11.4]VDRはミトコンドリア機能を調節し、糖尿病ラット腎小管細胞損傷の保護機序とした。 - -第70巻、2024年4月、103062.V

この図の元のデータは文献（2）から出ています。

(3)[もし=11.1]LONP 1は、ミトコンドリア機能を保護し、慢性腎症を軽減するためにHMGCS 2を標的とする。EMBO分子医学（2023）15:e16581https://doi.org/10.15252/emmm.202216581

免疫蛍光共局在分析mPTC（上、スケール：20 um）及びヒト腎組織（下、スケール：200 um）におけるLONP 1、HMGCS 2及びミトコンドリア。

この図の生データは文献（3）から出ている。