CCK-8キット（細胞増殖及び毒性検査）

Cell Counting Kit-8はCCK-8キットと略称され、MTT法の代替方法であり、WST（水溶性テトラゾール塩、化学名：2-（2-メトキシ-4-ニトロフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-（2,4-ジスルホベンゼン）-2 H-テトラゾール単ナトリウム塩）に基づく細胞増殖と細胞毒性に広く応用されている高速高感度検査キットである。薬物スクリーニング、細胞増殖測定、細胞毒性測定、腫瘍薬感受性などの試験に用いることができる。

使用方法：
一、標準曲線を作成する（細胞の具体数を測定する場合（細胞の具体数を測定する場合）
1、調製した細胞懸濁液中の細胞数を細胞計数板で計数し、その後細胞を接種する。
2、比例に従って培地等比で1つの細胞濃度勾配に希釈し、一般的には3-5個の細胞濃度勾配を行い、1群当たり3-6個の復孔を行う。
3、接種後に細胞壁に培養し、その後CCK-8試薬を加えて一定時間培養した後にOD値を測定し、細胞数を横軸（X軸）、OD値を縦軸（Y軸）とする標準曲線を作成した。）

二、細胞活性検査

1、96ウェルプレートに細胞懸濁液（100µL/ウェル）を接種する。培養プレートを培養箱に入れて予備培養した（37℃、5%CO 2の条件下）。

2、1ウェルに10µL CCK-8溶液を添加する（穴に気泡を生成しないように注意し、それらはOD値の読み取りに影響する）。

3、培養プレートを培養箱内で1〜4時間インキュベートした。

4、酵素スケールを用いて450 nmでの吸光度を測定する。

5、一旦OD値を測定せず、後で測定しようとする場合は、穴ごとに10µL 0.1 MのHClまたは1%SDS（W/V）溶液を加え、培地を覆って室温条件下で遮光保存することができる。24時間以内では吸光度は変化しない。

三、細胞増殖−毒性検査

培養プレートを培養箱で24時間予備培養した（37℃、5%CO 2の条件下）。

2、培養プレートに10µLの異なる濃度の測定対象物質を添加する。培養箱で適切な時間（例えば：6、12、24、または48時間）インキュベートする。

3、1ウェルに10µL CCK-8溶液を添加する（穴に気泡を生成しないように注意し、それらはOD値の読み取りに影響する）。測定対象物質に酸化性または還元性がある場合は、CCK-8を加える前に新鮮培地（培地を除去し、培地で細胞を2回洗浄した後、新しい培地を加えた）を交換し、薬物影響を除去することができる。

4、培養プレートを培養箱内で1〜4時間インキュベートした。

6、一旦OD値を測定せず、後で測定しようとする場合は、穴ごとに10µL 0.1 MのHClまたは1%SDS（W/V）溶液を加え、培養板を覆って室温条件下で遮光保存することができる。24時間以内では吸光度は変化しない。

活力計算：.

細胞活力（%）＝［A（投与）－A（空白）］/［A（0投与）－A（空白）］×100

A（薬物添加）：細胞、CCK-8溶液及び薬物溶液を有する孔の吸光度

A（ブランク）：細胞の孔を持たずに培地とCCK-8溶液を有する吸光度

A（0添加）：薬物溶液のない細胞、CCK-8溶液を有する孔の吸光度

細胞活力：細胞増殖活力または細胞毒性活力

注意事項：

①手探り接種細胞数とCCK-8試薬添加後の培養時間をいくつかのウェルを先に行うことを提案する。

③標準96ウェルプレートを用いた場合、壁貼り細胞の最小接種量は少なくとも1，000個／ウェル（100µL培地）であった。白血球を検出する際の感度は相対的に低いため、接種量は2500個/ウェル（100µL培地）以上が推奨されている。24ウェルプレートまたは6ウェルプレートを用いた実験を行う場合は、まず1ウェル当たりの接種量を計算し、1ウェル当たりの培地総体積の10%でCCK-8溶液を添加します。

④450 nmのフィルタがなければ、430〜490 nmの間の吸光度を有するフィルタを用いることができるが、450 nmが最も検出感度が高い。

⑤培地中のフェノールレッドの吸光度は計算時に、空洞中の本底の吸光度を差し引くことにより消去できるので、検出に影響を与えない。