アフラトキシンM 1免疫親和柱

アフラトキシン（Total Aflatoxins）M 1免疫親和カラム取扱説明書

【概要】

アフラトキシン（Aflatoxin）はアフラトキシン、寄生アスペルギルスなどの真菌による二次代謝物であり、世界保健機関のがん研究機関によって発がん性物質の1種類に分類されるとともに、毒性*の猛毒物質であり、様々な食品に広く存在している。トウモロコシ、落花生、米、小麦などの穀物とその副産物はアフラトキシンの主要な源であり、同時に飼料中のアフラトキシンB 1が動物の代謝を経て発生したアフラトキシンM 1は依然として強い毒性と発がん性を有し、牛乳、血液、組織などの食品にも広く存在している。肝癌の三大誘因の一つとして、アフラトキシンは胃癌、腸癌などの疾病の主要な原因でもあり、人類の健康に対して大きな脅威となっている。世界各国は食品、飼料中のアフラトキシンに厳しい*。2010年6月1日に施行された乳製品安全国家基準では、乳製品中のアフラトキシンM 1の検出について規定されており、主に使用されるサンプル前処理方法は免疫親和柱浄化法である。

【適用範囲と性能】

当社の真菌毒素免疫カラムシリーズ製品の試験形式は高性能の免疫親和カラムであり、HPLC（高効率液体クロマトグラフィー）、GC-MS（ガスクロマトグラフィー-質量分析併用器）、ELISA（酵素免疫吸着剤測定）を行う前にサンプルを整理（浄化）または濃縮するために設計されている。

牛乳、粉ミルク、発酵乳、チーズ、クリームなどのサンプル中のアフラトキシンM 1の定性、定量測定及びサンプル前処理に用いる。

カラム容量：≥100 ng

回収率：≥90%

【試験原理】

本製品の測定の基礎は抗原抗体反応であり、アフラトキシンM 1モノクローナル抗体はカラム内ゲルに結合し、サンプル中のアフラトキシンM 1は抽出、濾過、希釈され、その後、サンプル抽出液をアフラトキシンM 1によりゆっくりと免疫親和クロマトグラフィーカラムを通過し、免疫親和カラム内で、毒素は抗体と結合し、その後、洗浄免疫親和カラムは結合されていない他の物質を除去する。アフラトキシンM 1をメタノールで溶出し、測定のために分析装置に注入した。

【包装組成】

アフラトキシンM 1標準品（オプション）

25本/箱、3 mL柱管/枝

製品説明書1部

【必要で提供されていない設備及び試薬】

デバイス：

┅┅高速均質器又は組織均質機

┅𗈹粉砕機

┅┅200 mL/50 mLメスシリンダ

エンタルピー天秤：感量0.1 g

エンタルピーさんどけい

エンタルピー分液漏斗

𗈹𗈹微量ピペット：片道100 mL～1000 mL

┅┅溝目ろ紙（折り畳み迅速定性又は定量ろ紙）

┅┅50 mL漏斗

エンタルピー回転蒸発器

エンタルピー使い捨てガラス試験管

┅┅ポンプ流操作フレーム（空気ポンプ、異なる容積のガラス注射器などを含む）

┅┅ビーカー、容量ボトル、テーパボトルなど

試薬：

エンタルピーメタノール（クロマトグラフィーレベル）

9477アセトニトリル（クロマトグラフィーレベル）

エンタルピー石油エーテル

エンタルピー蒸留水又は脱イオン水

エンタルピー＊溶液（0.5 mol/L）秤量2 g＊を100 mL水に溶解する

【サンプル処理手順】

（一）牛乳

┅┅100 mL牛乳水浴を40 oCに加熱する、

┅𗈹4000 r/min遠心分離15 min、50 mL清澄液を収集して使用する

（二）粉ミルクと粉状乳幼児用調合食品

┅┅秤量10 g粉ミルクサンプルを採取し、100 mL 50 oC水を何度も少量加え、攪拌し、粉ミルクを十分に溶解させる

┅𗈹6000 r/min遠心分離15 min、50 mL清澄液を収集して使用する

エンタルピーは60 gの混合試料を秤量し、0.5 mol/Lの*溶液を用いて酸度計でpHを7.4に下げるよう指示した、

┅┅高速ホモジナイザーを用いて9500回転/分でホモジナイズに5 min教える

┅┅水浴を40 oCに加熱する、

┅𗈹4000 r/min遠心分離15 min、50 mL清澄液を収集して使用する

（四）チーズ

┅┅秤量採取して細かく切り、10目の丸穴ふるいを通して均一に混合した試料5 gを50 mL遠心管に入れ、水2 mLとメタノール30 mLを加える、

エンタルピーは高速ホモジナイザーを用いて9500 r/分でホモジナイズに5 min教える、

エンタルピー超音波抽出30 min、

エンタルピーは6000 r/分で15分間遠心分離し、上清を収集し、250 mL分液漏斗に移した。

┅┅分液漏斗に石油エーテル30 mL（4.3）を添加し、2分間振動する、

┅┅層化した後、下層を50 mLビーカーに移し、石油エーテル層を廃棄した。

エンタルピーは石油エーテルで2回繰り返し抽出した。

┅┅下層溶液を100 mL丸底フラスコに移し、減圧約2 mLに濃縮し、┅┅濃縮液を遠心管に入れ、フラスコをアセトニトリル−水溶液（1＋4）5 mLで2回洗浄し、洗浄液を一緒に50 mL遠心管に入れ、

エンタルピーは水で約50 mLに希釈し、6000回転/分で5分間遠心分離し、上澄み液を浄化処理に供した。

（五）バター

┅┅5 gの試料を秤量し、50 mLビーカーに入れる、

┅┅20 mL石油エーテルを用いて溶解し、250 mL栓付きコーンボトルに移した。

┅┅に水20 mLとメタノール30 mLを加え、30 min振動させた後、すべての液体を分液漏斗中に移動する、

┅┅層化した後、下層溶液をすべて100 mL丸底フラスコに移し、回転蒸発器で約5 mLに減圧濃縮し、水を加えて約50 mLに希釈し、浄化処理に供する。

【親和柱浄化工程】

┅┅免疫親和性カラムを50.0 mLガラス注射器の下に接続する。透明液50.0 mLを正確に移してガラス注射器に注入する、

┅┅空気圧力ポンプをガラス注射器に接続し、圧力を調節して溶液を約2-3 mL/minの流速でゆっくりと免疫親和柱を通過させ、2 ~ 3 mLの空気が柱体を通過するまで、

┅┅10 mlガラス注射器を親和柱に接続し、注射器に10 mlの水を加え、圧力を調節して水を約6 mL/min流速で親和柱を洗浄した。

エンタルピーは正確に4 mLクロマトグラフィー級アセトニトリルを加えて溶出し、流速は1 mL/min ~ 2 mL/minであり、すべての溶出液をガラス試験管に集め、検査用に供した。

【結果判定】

免疫親和カラム浄化後、収集されたアセトニトリル溶離液は蛍光計またはHPLCを用いて直接検出することができ、また薄層クロマトグラフィーまたは酵素免疫キットを用いて検出することができる。収集された4 ml溶離液中のアフラトキシン含有量は、牛乳サンプル50 ml、発酵乳サンプル又は粉ミルクサンプル5 g、チーズサンプル及びクリームサンプル中のアフラトキシンM 1の含有量に相当する。

HPLC検査に他の溶媒が必要な場合は、アセトニトリル溶離液の窒素ガスを吹き込んで乾燥させ、再溶解することができます

【注意事項】

┅┅黄アスペルギルス毒素の危害は極めて大きく、手袋を着用して操作すべきである。

┅┅使用済みガラス容器及びアフラトキシン溶液は、5%濃度の次亜塩素酸ナトリウム溶液で一晩浸漬することが好ましい。

┅┅有効日を過ぎた免疫親和性カラムを使用しないでください。

【貯蔵条件及び保存期間】

貯蔵条件：親和柱2〜8℃で保存し、凍結保存できない。

保存期間：この製品の有効期間は12ヶ月です。