ヒトβ−ディフェンス2（HβD−2）キット

本キットはドナー外研究用のみであり、臨床診断用ではありません

本キットは、血清、血漿、組織ホモジネート及び関連液体サンプル中のヒトβ−防御素2（HβD−2）の含有量をインビトロで定量的に検出するために使用される。

有効期限：6ヶ月

保存条件：2-8℃

キット構成：

備考：

1.（96 T/48 T）包装を開けたら、すべての品物がそろっているかどうかをタイムリーにチェックしてください。

2.標準品濃度は順に：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3.大量の正常標本検査を経て、標本の正常濃度値はすべてキットが提供した検査範囲内であり、実験過程中に直接50μLサンプルをサンプリングすればよい。一部のサンプル値が標準品濃度を超えている場合は、サンプル希釈液を用いてサンプルを適切に希釈してから実験を行う。

検査前準備：

1.20分前に冷蔵庫からキットを取り出し、室温まで平衡にしてください。

2.冷蔵庫から取り出した濃縮洗浄液は結晶化している可能性があり、正常な現象である、室温に置き、均一に軽く振り、結晶が溶解してから洗浄液を配置する。濃縮洗浄液20 mlを蒸留水または脱イオン水で希釈して400 mlの動作濃度の洗浄液に配置し、使い切れていないものは4℃に戻すことができる

3.20×洗浄緩衝液の希釈：蒸留水を1：20で希釈する、すなわち1部20×洗浄緩衝液に19部の蒸留水を加える。

ヒトβ−ディフェンス2（HβD−2）ELISAキット

実験原理：

キットは二重抗体ワンステップサンドイッチ法による酵素結合免疫吸着試験（ELISA）を用いた。ヒトβ−防御素2（HβD−2）で捕捉された抗体を予めカプセル化したカプセルに、標本、標準品、HRP標識の検出抗体を順に加え、インキュベートし、洗浄した。基質TMBを用いて発色し、TMBはペルオキシダーゼの触媒下で青色に転化し、酸の作用下で黄色に転化する。色の濃淡は試料中のヒトβ−ディフェンス2（HβD−2）と正の相関を示した。酵素スケールを用いて450 nm波長で吸光度（OD値）を測定し、サンプル濃度を計算した。

実験に必要な自己準備試験器材：

1.酵素スケール（450 nm）

2.高精度サンプラ及びガンヘッド：0.5-10 uL、2-20 uL、20-200 uL、200-1000 uL

3.37℃恒温タンク

4.蒸留水又は脱イオン水

サンプル処理と要求：

1.血清：血清分離管に収集した全血標本を室温で2時間或いは4℃で一晩放置し、その後1000×gで20分間遠心分離し、上清を採取すればよく、或いは上清を-20℃或いは-80℃に置いて保存するが、繰り返し凍結融解を避けるべきである。

2.血漿：EDTAまたはヘパリンを抗凝固剤として用いて標本を採取し、そして標本を採取後の30分間以内に2-8℃1000×gで15分間遠心分離し、上清を採取すれば検査でき、あるいは上清を-20℃または-80℃に置いて保存するが、繰り返し凍結融解を避けるべきである。

3.組織ホモジネート：予冷したPBS（0.01 M、pH＝7.4）で組織を洗浄し、残留血液（ホモジネート中で分解した赤血球は測定結果に影響する）を除去し、秤量後に組織を切断する。切断した組織と対応する体積のPBS（一般的に1：9の重量体積比、例えば1 gの組織サンプルは9 mLのPBSに対応し、具体的な体積は実験の必要に応じて適切に調整し、記録することができる。PBSにプロテアーゼ阻害剤を添加することを推奨）をガラスホモジナイザーに添加し、氷の上で十分に研磨する。組織細胞をさらに分解するために、均質スラリーを超音波破砕したり、凍結融解を繰り返したりすることができる。均質液を5000×gで5 ~ 10分間遠心分離し、上清を採取して検査した。

4.細胞培養物上清：1000×gを20分間遠心分離し、上清を採取すれば検査でき、或いは上清を-20℃或いは-80℃に置いて保存するが、繰り返し凍結融解を避けるべきである。

5.その他の生物標本：1000×gは20分間遠心分離し、上清を採取すれば検査できる。

6.サンプル外観：サンプルは澄みきって透明で、懸濁物は遠心分離して除去しなければならない。

7.サンプル保存：サンプル収集後、1週間以内に検査を行う場合は4℃に保存でき、適時に検査できない場合は、1回の使用量に分けて、-20℃（1ヶ月以内に検査）、または-80℃（6ヶ月以内に検査）に凍結保存し、繰り返し凍結融解を回避し、サンプルの溶血は検査結果に影響するため、溶血サンプルはこの検査を行うべきではない。

注意事項：

1.正確な結果を保証するために、規定の時間と温度に厳格に従ってインキュベーションを行う。すべての試薬は使用前に室温20〜25℃に到達しなければならない。使用直後に試薬を冷蔵保存する。

2.洗濯板が正しくないと、不正確な結果を招くことがあります。基質を添加する前に、できるだけ孔内の液体を吸引するようにしてください。温育中は微孔を乾燥させないでください。

3.プレートの底に残っている液体と指印を除去し、そうしないとOD値に影響します。

4.基質発色液は無色または薄い色を呈するべきで、すでに青くなった基質液は使用できない。

5.誤った結果を招かないように試薬と標本の交差汚染を避ける。

6.貯蔵及び温育時に強い光が直接照射されないようにする。

7.室温に平衡した後、密封バッグを開けて、水滴が冷たいスラットに凝集しないようにする。

漂白成分はいずれもキット内の反応試薬の生物活性を破壊する。

9.期限切れ製品は使用できません。

10.病気を伝播する可能性がある場合は、すべてのサンプルを管理し、規定の手順に従ってサンプルと検査装置を処理しなければならない。

操作手順：

1.室温60 min平衡後のアルミニウム箔袋から所望のスラットを取り出し、残りのスラットを自己封止袋で密封して4℃に戻した。

2.標準品孔とサンプル孔を設置し、標準品孔にそれぞれ異なる濃度の標準品50μLを添加する。

3.試料孔にaを測定すべき試料50μLを添加する、空白の穴は入れない。

4.空洞を除いて、標準品孔とサンプル孔の各孔にワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識の検出抗体100μLを添加し、封板膜を用いて反応孔を封止し、37℃水浴鍋または恒温箱で60 minインキュベートした。

5.液体を捨て、吸水紙を上にたたいて乾かし、穴ごとに洗浄液（350μL）を満タンにし、1 min静置し、洗浄液を振り切って、吸水紙を上にたたいて乾かし、このように洗濯板を5回繰り返した（洗濯機で洗濯板を洗うこともできる）。

6.1ウェル当たり基質A、Bを各50μL添加し、37℃で15分間光を避けてインキュベートした。

7.終端液を1ウェル当たり50μL、15 min添加し、450 nm波長で各ウェルのOD値を測定した。

実験結果の計算：

標準曲線の描画：Excelワークシートにおいて、標準品濃度を横座標とし、OD値に対応して縦座標とし、標準品線形回帰曲線を描画し、曲線方程式に基づいて各サンプル濃度値を計算する。

（参考までにこの図をご覧ください）

ヒトβ−ディフェンス2（HβD−2）ELISAキット

パフォーマンス：

1.検査範囲：25 pg/mL-800 pg/mL。

2.感度：低検出濃度は1.0 pg/mL未満である。

3.特異性：他の可溶性構造類似体と交差反応しない。

4.繰り返し性：板内変異係数は10%未満、板間変異係数は15%未満である。

ヒント：

1.タンパク質溶液を混合または再溶解する場合、できるだけ泡が出ないようにする。

2.交差感染を避けるために、異なる濃度の標準品、サンプル、異なる試薬を配置するには、銃のヘッドを交換する必要があります。また異なる試薬はそれぞれ異なる移液槽を使用してください。

3.インキュベーションのたびに、結果の正確性を保証するために封板ゴムを正しく使用してください。

4.混合後の発色基質は上板の前で無色でなければならないので、光を避けて保存してください。微孔板の後であれば、物色から異なる深さの青に変わります。

5.終止液上板の順序は発色基質上板の順序と一致しなければならない、終止液を添加した後、孔内の色は青から黄色に変化した、孔内に緑色があれば、孔内の液体が均一に混ざっていないことを示し、よく混ぜてください。

説明：

1.現在の条件及び科学技術レベルはまだすべての供給業者が提供するすべての原料に対して全面的な鑑定と分析を行うことができないため、本製品には一定の品質技術リスクが存在する可能性がある。

2.実験結果は試薬の有効性、実験者の関連操作及びその時の実験環境と密接に関連しているので、必ず十分な標本バックアップを用意してください。

3.ロットによって同じ製品には若干の差がある可能性があります。例えば、検査制限、感度及び発色時間など、キット内の説明書に基づいて実験操作を行ってください。ウェブサイトの電子版説明書は参考にしてください。

4.本キットのセット剤をすべて使用してこそ、検査効果を保証でき、他のメーカーの製品を混用することはできない。本キットの実験説明を厳守してこそ、検査結果が得られる。